Rozdíl mezi (dvoufotonovými, konfokálními) fluorescenčními mikroskop a obyčejný mikroskop
Základním principem excitace dvoufotonu je to, že při vysoké hustotě fotonu mohou fluorescenční molekuly současně absorbovat dva fotony s dlouhou vlnovou délkou a po krátké době takzvaného excitovaného stavového života emitovat kratší foton vlnové délky; Účinek je stejný jako použití fotonu s polovinou vlnové délky dlouhé vlnové délky k vzrušení fluorescenčních molekul. Dvě excitace fotonů vyžaduje vysokou hustotu fotonu a aby se zabránilo škodlivým buňkám, dvoufotonová mikroskopie používá vysokoenergetické pulzní lasery. Laser emitovaný tímto laserem má vysokou špičkovou energii a nízkou průměrnou energii, se šířkou pulsu pouze 100 femtosekund a frekvencí až 80 až 100 megahertzů. Při použití vysoce numerického objektivu apertury k zaostření fotonů pulzního laseru je hustota fotonu v ohnisku objektivu objektivu nejvyšší a dvoufotonová excitace se vyskytuje pouze v ohnisku objektivní čočky. Proto dvoufotonový mikroskop nevyžaduje konfokální dírku, což zlepšuje účinnost detekce fluorescence.
Fluorescenční molekula obecně může fluorescenční jevy v důsledku nízké hustoty fotonu excitačního světla absorbovat pouze jeden foton najednou a poté emitovat další fluorescenční foton prostřednictvím radiačního přechodu, který je známý jako jediný fotonovou fluorescenci. U fluorescenčních excitačních procesů používajících lasery jako zdroje světla, mohou dojít k dvoufotonu nebo dokonce multiphotonové fluorescenční jevy. V tomto případě má použitý zdroj excitačního světla vysokou intenzitu a hustotu fotonu, která splňuje požadavek, aby fluorescenční molekuly absorbovaly dva fotony současně. V procesu používání obecného laseru jako zdroje excitačního světla je hustota fotonu stále nedostatečná k vytvoření jevu absorpce dvou fotonů. Obvykle se používají femtosekundové pulzní lasery, s okamžitým výkonem dosahujícím úrovni megawattu. Vlnová délka dvoufotonové fluorescence je proto kratší než vlna excitačního světla, což odpovídá účinku vyvolané excitací poloviční excitační vlnové délky.
Znalosti související s konfokální fluorescenční mikroskopií
Základním principem konfokální fluorescenční mikroskopie je použití bodového světelného zdroje k ozáření vzorku a vytvoření dobře definovaného malého světla na ohniskové rovině. Fluorescence emitovaná z tohoto místa po ozařování se shromažďuje objektivem objektivu a odesílána zpět podél původní cesty ozařování k rozdělovači paprsku složeného z dichroického zrcadla. Spektrometr odesílá fluorescenci přímo do detektoru. Před zdrojem světla i detektoru je dírka zvaná dírka osvětlení a detekční dírku. Geometrické rozměry obou jsou konzistentní, přibližně 100-200 nm; Ve srovnání s světelným skvrnami na ohniskové rovině jsou oba konjugované, což znamená, že světelné skvrny prochází řadou čoček a může se nakonec zaměřit na zároveň dírku osvětlení i detekční dírku. Tímto způsobem se světlo z ohniskové roviny může sbližovat v rozsahu detekční díry, zatímco rozptýlené světlo shora nebo pod ohniskovou rovinou je blokováno mimo detekční otvor a nelze jej zobrazovat. Skenování bodu vzorku za laserem laserem, fotomultiplinární trubice po detekci dírky také získá odpovídající konfokální obraz světelného bodového bodu po bodě, převede jej na digitální signál a přenáší ji na počítač a nakonec ji agreguje na jasný konfokální obraz celé ohniskové roviny na obrazovce.
