Přímé počítání mikroorganismů mikroskopem
Experimentální princip
Přímé počítání pod mikroskopem pomocí hemocytometru je běžně používanou metodou mikrobiálního počítání. Výhodou této metody je, že je intuitivní a rychlá. Vhodně naředěnou bakteriální suspenzi (nebo suspenzi spor) umístěte do počítací komůrky mezi sklíčko a krycí sklo hemocytometru a spočítejte pod mikroskopem. Protože je objem počítací komůrky pevný (0.1mm2), lze jej převést na celkový počet mikroorganismů na jednotku objemu podle počtu mikroorganismů pozorovaných pod mikroskopem. Protože tato metoda počítá součet živých a mrtvých bakterií, nazývá se také metoda celkového počtu bakterií.
Hemocytometr je obvykle speciální skleněné sklíčko, na kterém čtyři drážky tvoří tři plošiny. Plošina uprostřed je rozdělena na dvě poloviny krátkou horizontální drážkou. Na platformě je na každé straně vyrytá mřížka. Každá mřížka je rozdělena na devět velkých čtverců. Velký čtverec uprostřed je počítací místnost. Mikroorganismy se počítají v počítací komoře. Struktura desky pro počítání krvinek je znázorněna na obrázku Ⅷ-1.
Měřítko počítací místnosti má obecně dvě specifikace, první je, že velký čtverec je rozdělen na 16 středních čtverců a každý střední čtverec je rozdělen na 25 malých čtverců (obrázek Ⅷ-2); druhý je velký čtverec. Čtverec je rozdělen na 25 středních čtverců a každý střední čtverec je rozdělen na 16 malých čtverců (obrázek Ⅷ-1, C). Ale bez ohledu na to, o jaký druh počítací desky se jedná, počet malých čtverců v každém velkém čtverci je stejný, tj. 16×25=400 malých čtverců, jak je znázorněno na obrázku Ⅷ-2.
Délka strany každého velkého čtverce je 1 mm a plocha každého velkého čtverce je 1 mm2. Po zakrytí krycího skla je výška mezi podložním sklíčkem a krycím sklem 0,1 mm, takže objem počítací komory je 0,1 mm3.
Při počítání obvykle spočítejte celkový počet bakterií v pěti středních mřížkách, pak získejte průměrnou hodnotu každé střední mřížky a poté vynásobte 16 nebo 25, abyste získali celkový počet bakterií ve velké mřížce, a poté převeďte na celkový počet bakterií v 1 ml bakteriálního roztoku.
Laboratorní vybavení
Hemocytometr, mikroskop, krycí sklíčko, sterilní kapilára;
Experimentální materiály
Suspenze Saccharomyces cerevisiae
Experimentální postup (metoda přímého počítání pomocí mikrobiálního mikroskopu)
1. ředění
Řádně nařeďte suspenzi Saccharomyces cerevisiae. Pokud bakteriální roztok není hustý, není třeba jej ředit.
2. Mikroskopická počítací místnost
Před přidáním vzorků proveďte mikroskopickou kontrolu počítací komory počítací desky. Pokud jsou nečistoty, je třeba je před počítáním vyčistit.
3. přidejte vzorek
Zakryjte čistou a suchou destičku hemocytometru krycím sklem a poté pomocí sterilního kapátka s jemnými ústy kápněte malou kapku zředěného roztoku Saccharomyces cerevisiae z okraje krycího skla (ne příliš mnoho), aby se roztok bakterií je blízko mezery podél mezery. Kapilární osmóza vstupuje do počítací komůrky sama a obecná počítací komůrka může být naplněna bakteriální kapalinou. Dávejte pozor, abyste neměli vzduchové bubliny.
4. mikroskop počet
Po 5 minutách odpočinku umístěte hemocytometr na stolek mikroskopu, nejprve pomocí nízkovýkonné čočky najděte umístění počítací komůrky a poté přepněte na vysokovýkonnou čočku pro počítání. Pokud se před počítáním zjistí, že bakteriální roztok je příliš hustý nebo příliš řídký, je nutné před počítáním znovu upravit ředění. Ředění vzorku obecně vyžaduje přibližně 5-10 bakterií v každé buňce. Každá počítací komora vybírá bakterie v 5 středních mřížkách (volitelně 4 rohové a středové mřížky) pro počítání. Bakterie na čáře mřížky se obecně počítají pouze na horní a pravé čáře. V případě pučení kvasinek, kdy velikost těla pupenu dosahuje poloviny mateřské buňky, napočítejte dvě bakterie. Spočítejte vzorek pro výpočet bakteriálního obsahu vzorku z hodnot napočítaných ve dvou počítacích komůrkách.
5. Čištění hemocytometru
Po použití destičku na počítání krvinek na kohoutku opláchněte proudem vody, nemyjte ji tvrdými předměty a po umytí ji osušte sami nebo fénem. Mikroskopické vyšetření, pozorujte, zda jsou v každé buňce zbytkové bakterie nebo jiné sedimenty. Pokud není čistý, musí se opakovaně umýt, dokud nebude čistý.
