Proč musím používat konfokální mikroskop?
1. Optický mikroskop byl zdokonalen díky úsilí a vylepšením našich velkých předchůdců. Ve skutečnosti nám běžný mikroskop může poskytnout krásné mikroskopické snímky snadno a rychle. Avšak událostí, která způsobila revoluci ve světě téměř dokonalých mikroskopů, byl vynález „laserového skenovacího konfokálního mikroskopu“. Tento nový typ mikroskopu se vyznačuje optickým systémem, který extrahuje obrazovou informaci pouze z povrchu, na kterém je soustředěno ohnisko, a změnou ohniska při obnově získané informace v obrazové paměti je možné získat ostrý obraz s úplné 3-dimenzionální informace. Tímto způsobem je možné snadno získat informace o tvaru povrchu, které nelze potvrdit běžným mikroskopem. Navíc, zatímco u konvenčních optických mikroskopů jsou „zvyšování rozlišení“ a „prohlubování hloubky ostrosti“ konfliktní podmínky, zejména při velkém zvětšení, tento problém je řešen u konfokálních mikroskopů.
2. Výhody konfokálního optického systému
Schematické schéma laserového konfokálního mikroskopu
Konfokální optický systém je bodové osvětlení vzorku, přičemž odražené světlo je rovněž přijímáno pomocí bodového receptoru. Když je vzorek umístěn v ohnisku, téměř všechno odražené světlo dosáhne fotoreceptor, a když je vzorek neostrý, odražené světlo nemůže dosáhnout fotoreceptoru. Jinými slovy, v konfokálním optickém systému je na výstupu pouze obraz, který se shoduje s ohniskem, a skvrny a zbytečné rozptýlené světlo jsou blokovány.
3. Proč používat laser?
V konfokálním optickém systému je vzorek osvětlen v bodě a odražené světlo je přijímáno bodovým senzorem. Proto je nutný bodový zdroj světla. Lasery jsou do značné míry bodovým zdrojem světla. Ve většině případů je zdrojem světla pro konfokální mikroskopy laserový zdroj světla. Kromě toho, monochromatičnost, směrovost a vynikající tvar paprsku laserů jsou důležitými důvody pro jejich široké přijetí.
4. Je možné pozorování v reálném čase založené na vysokorychlostním skenování.
Pro laserové skenování je v horizontálním směru použita akustická optická vychylovací jednotka (Acoustic Optical Deflector, AO prime) a ve vertikálním směru servoelektronické skenovací zrcadlo s řízeným paprskem (Servo Galvano-mirror). Protože v AO deflektoru nedochází k žádným mechanickým vibracím, je možné vysokorychlostní skenování a pozorování na obrazovce monitoru v reálném čase. Vysoká rychlost tohoto fotoaparátu je velmi důležitou položkou, která přímo ovlivňuje rychlost ostření a načítání polohy.
5. Vztah mezi polohou zaostření a jasem
V konfokálním optickém systému je vzorek umístěn správně do ohniskové polohy, když je jasnost zui velká, před a za ním se jeho jas prudce sníží (obrázek 4 plná čára). Tato citlivá selektivita ohniskové roviny je principem výškové orientace konfokálního mikroskopu a expanze hloubky ohniska. Naproti tomu běžné optické mikroskopy nevykazují žádnou významnou změnu jasu před a za ohniskovou polohou (tečkovaná čára na obr. 4).
6. Vysoký kontrast, vysoké rozlišení
V běžném optickém mikroskopu odražené světlo z nezaostřené části mikroskopu interferuje a překrývá se s ohniskovou zobrazovací částí mikroskopu, což má za následek snížení kontrastu obrazu. Naproti tomu v konfokálním optickém systému je rozptýlené světlo mimo ohnisko a uvnitř čočky objektivu téměř úplně odstraněno, což má za následek snímky s velmi vysokým kontrastem. Navíc se zlepšila rozlišovací schopnost mikroskopu, protože světlo prochází čočkou objektivu dvakrát, čímž se bodový obraz zaostří.
7. Funkce optické lokalizace
V konfokálním optickém systému je odražené světlo stíněno mikroaperturou v bodě jiném, než je ohnisko. Výsledkem je, že při pozorování trojrozměrného vzorku je obraz vytvořen, jako by byl vzorek rozříznut s ohniskem (obr. 5). Tento efekt se nazývá optická lokalizace a je jedním z rysů konfokálních optických systémů.
