Pochopení konfokální fluorescenční mikroskopie
Základní princip konfokální fluorescenční mikroskopie: Použijte bodový světelný zdroj k osvětlení preparátu, aby se vytvořil malý, dobře definovaný světelný bod v ohniskové rovině. Fluorescence emitovaná skvrnou po osvícení je shromažďována čočkou objektivu a vrácena do dichroického zrcadla podél původní světelné dráhy osvětlení. tvoří rozdělovač paprsků. Spektrometr posílá fluorescenci přímo do detektoru. Před světelným zdrojem a detektorem je dírka, která se nazývá dírka osvětlení a dírka detekce. Geometrické rozměry obou jsou konzistentní, přibližně 100-200nm; vzhledem ke světelnému bodu v ohniskové rovině jsou oba sdružené, to znamená, že světelný bod prochází řadou čoček a nakonec může být zaostřen na osvětlovací dírku a detekční dírku současně. Tímto způsobem lze světlo z ohniskové roviny koncentrovat v dosahu detekčního otvoru, zatímco rozptýlené světlo nad nebo pod ohniskovou rovinou je blokováno mimo detekční otvor a nelze jej zobrazit. Vzorek je bod po bodu snímán laserem a trubice fotonásobiče za detekční dírkou také získá konfokální obraz odpovídajícího světelného bodu bod po bodu, který je převeden na digitální signál a přenesen do počítače a nakonec agregován na obrazovky do jasného konfokálního obrazu celé ohniskové roviny. .
Každý snímek ohniskové roviny je ve skutečnosti optickým řezem preparátem. Tento optický průřez má vždy určitou tloušťku a nazývá se také optický tenký průřez. Protože intenzita světla v ohnisku je mnohem větší než intenzita světla v neostřeném a světlo v neohniskové rovině je filtrováno dírkou, je hloubka ostrosti konfokálního systému přibližně nulová. Skenováním ve směru osy Z lze realizovat optickou tomografii a vytvořit požadovanou. Pozorujte dvourozměrný optický řez na zaostřeném místě vzorku. Kombinací skenování v rovině XY (ohnisková rovina) se skenováním v ose Z (optická osa), akumulací spojitých úrovní dvourozměrných obrazů a jejich zpracováním pomocí specializovaného počítačového softwaru lze získat trojrozměrný obraz vzorku.
To znamená, že detekční dírka a dírka světelného zdroje jsou vždy zaostřeny na stejný bod, takže fluorescence excitovaná mimo ohniskovou rovinu nemůže vstoupit do detekční dírky.
Jednoduchým vyjádřením pracovního principu laserového konfokálu je, že jako zdroj světla používá laser. Na základě tradičního zobrazování pomocí fluorescenčního mikroskopu je přidáno laserové skenovací zařízení a konjugované zaostřovací zařízení a systém je řízen počítačem pro sběr a zpracování digitálních snímků.
