Existují dva typy fluorescenčních mikroskopů z hlediska jejich optické dráhy
1. Transmisní fluorescenční mikroskop: Zdroj excitačního světla prochází materiálem vzorku přes kondenzorovou čočku, aby se excitovala fluorescence. Běžně se používá kolektor tmavého pole a obyčejný kolektor lze použít i k nastavení zrcadla tak, aby bylo excitační světlo přesměrováno a přemostěno na preparát. Jedná se o starší fluorescenční mikroskop. Výhodou je, že fluorescence je silná při malém zvětšení, ale nevýhodou je, že fluorescence klesá s rostoucím zvětšením. Proto je lepší pozorovat větší vzorky materiálů.
2. Epi-fluorescenční mikroskop je nový typ fluorescenčního mikroskopu vyvinutý v moderní době. Rozdíl je v tom, že excitační světlo dopadá z čočky objektivu dolů na povrch preparátu, to znamená, že stejná čočka objektivu se používá jako osvětlovací kondenzor a čočka objektivu pro sběr fluorescence. Ve světelné dráze, která je vzdálena 45 stupňů od lehkého uranu, je třeba přidat dichroický dělič paprsku. Budící světlo se odráží do čočky objektivu a shromažďuje se na vzorku. Fluorescence generovaná vzorkem a excitační světlo odražené povrchem čočky čočky objektivu a povrchem krycího skla vstupují do čočky objektivu současně a vracejí se do dvoubarevného rozdělovače paprsku, aby bylo excitační světlo odděleno od fluorescence , zbytkové excitační světlo je absorbováno blokovacími filtry. Například přechod na kombinaci různého excitačního filtru/dvoubarevného rozdělovače paprsku/blokovacího filtru může splňovat potřeby různých produktů fluorescenční reakce. Výhodou tohoto typu fluorescenčního mikroskopu je, že osvětlení zorného pole je rovnoměrné, zobrazení je jasné a čím větší zvětšení, tím silnější fluorescence.
