Standardní postup pro kalibraci polarizátorů v polarizačním mikroskopu
Fluorescenční mikroskop se od běžného optického mikroskopu liší tím, že nepozoruje vzorky pod osvětlením běžných světelných zdrojů. Místo toho používá určitou vlnovou délku světla (obvykle ultrafialové světlo, modrofialové světlo) k excitaci fluorescenčních látek uvnitř vzorku pod mikroskopem, což způsobí, že emitují fluorescenci. Úlohou zdroje světla ve fluorescenčním mikroskopu tedy není přímé osvětlení, ale jako zdroj energie pro excitaci fluorescenčních látek uvnitř preparátu. Důvodem, proč můžeme pozorovat vzorky, není osvětlení světelného zdroje, ale fluorescenční jev, který vykazují fluorescenční látky uvnitř vzorku po absorpci excitované světelné energie. Z toho je vidět, že charakteristikou fluorescenční mikroskopie je především to, že její světelný zdroj může dodávat velké množství excitačního světla v určitém rozsahu vlnových délek, takže fluorescenční látky ve vzorku mohou získat potřebnou intenzitu excitačního světla. Zároveň musí mít fluorescenční mikroskopy odpovídající filtrační systémy. Fluorescenční mikroskop je základním nástrojem fluorescenční chemie tkání. Skládá se z hlavních komponent, jako je ultra-vysokonapěťový světelný zdroj, filtrační systém (včetně excitačních a potlačovacích filtračních desek), optický systém a fotografický systém. Využívá světlo určité vlnové délky k excitaci vzorku a emitování fluorescence.
1. Metody fluorescenční excitace: Podle rozsahu vlnových délek světla existují dva typy: UV excitační metoda (využívá ultrafialové osvětlení) a BV excitační metoda (pomocí modrého fialového světla). Metoda UV excitace využívá k excitaci blízké ultrafialové světlo kratší než 400 nm. Tato metoda nemá viditelné excitační světlo, takže pozorovaná fluorescence vykazuje vlastní fluorescenci barviva, takže je snadné odlišit specifickou fluorescenci na vzorku od vlastní fluorescence tkáně pozadí.
2. BV excitační metoda: Zahrnuje excitaci z ultrafialového na modré světlo se středem na 404nm a 434nm. Tato metoda používá k ozařování vzorku modré světlo, takže cut{4}}filtr fluorescenčního pozorovacího systému musí používat filtr, který dokáže zcela blokovat modré světlo a plně procházet požadovanou zelenou a žlutou fluorescencí. Fluorescenční pigmenty používané pro fluorescenční protilátkovou metodu. Maximální vlnová délka absorpce excitačního světla a maximální emisní vlnová délka fluorescence jsou relativně blízko, takže filtr použitý v metodě buzení BV musí používat filtr s ostrým řezem. Tato metoda může používat modré světlo jako excitační světlo, takže absorpční účinnost fluorescenčních pigmentů je vysoká a lze získat jasnější snímky. Nevýhodou je, že fluorescence pod 500nm není vidět, zatímco fluorescence nad 500nm způsobuje, že celý obraz vypadá žlutě. Ve fluorescenční protilátkové metodě je specifičnost většinou určena barvou jedinečnou pro fluorescenční pigmenty, takže při diskusi o jemné specifičnosti mají nevýhody BV excitační metody uvedené výše často významný dopad.
