Barvící techniky a mikroskopické pozorování mikroorganismů
Jednoduché barvení bakterií
1 Cíle
1.1 Naučit se základní techniky mikrobiálního nátěru a barvení.
1.2 Zvládnout jednoduchou metodu barvení bakterií.
1.3 Seznámit se s morfologickými charakteristikami bakterií a upevnit učení se používání olejových zrcadel a technik aseptických operací.
2 Princip Rozmazání a barvení bakterií je základní technikou mikrobiologických experimentů. Buňky bakterií jsou malé a průhledné, nejsou snadno rozpoznatelné pod běžným světelným mikroskopem a musí být obarveny. Použití jediného barviva k obarvení bakterií, takže obarvený organismus a pozadí tvoří jasný barevný rozdíl, takže jejich morfologie a struktura může být jasněji pozorována. Tato metoda se snadno provádí a je vhodná pro pozorování celkového tvaru organismu a uspořádání bakterií. Pro jednoduché barvení se běžně používají alkalická barviva, protože v neutrálních, alkalických nebo slabě kyselých roztocích jsou bakteriální buňky obvykle negativně nabité a když jsou alkalická barviva ionizována, barvící část jejich molekul je nabita kladně, takže barvící část alkalických barviv se může snadno vázat na bakterie, aby se bakterie zbarvily. Obarvené bakteriální buňky ostře kontrastují s pozadím a jsou snadněji rozpoznatelné pod mikroskopem. Běžně používaná barviva pro jednoduché barvení zahrnují merocyaninovou modř, krystalovou violeť a bazickou sloučeninovou červeň. Při bakteriálním rozkladu cukru za vzniku kyseliny tak, že pH média klesá, kladný náboj bakterií se zvyšuje a lze je pak použít k barvení červenou, kyselou červení nebo konžskou červení a jinými kyselými barvivy. Bakterie musí být před barvením fixovány. Jeho účel je dvojí: jedním je zabít bakterie a přimět bakterie přilnout ke sklíčku; druhým je zvýšení její afinity k barvivu. Běžně se používají dvě metody: zahřívání a chemická fixace. Snažte se při fixaci zachovat původní morfologii buněk.
3 Materiály
3.1 Kmen Bacillus subtilis 12-18h šikmá kultura na živném agaru, Staphylococcus aureus asi 24 hodinová kultura na živném agaru, 24h kultura na živném agaru Escherichia coli, šikmá kultura na agaru z pekařských kvasnic.
3.2 Barvivo Lueovo alkalické barvivo methylenovou modří (nebo barvivo krystalová violeť šťavelanu amonného), červené barvivo sloučeniny kyseliny karbolové.
3.3 Nástroje nebo jiné příslušenství Mikroskop, alkoholová lampa, sklíčko, očkovací kroužek, držák sklíčka, dvouvrstvá lahvička (naplněná cedrovým olejem a xylenem), mikroskopický papír, fyziologický roztok nebo destilovaná voda atd.
4 Postup Stěr → sušení → fixace → barvení → mytí → sušení → mikroskopické vyšetření.
5 kroků
5.1 Nátěr Vezměte dvě čistá a bezolejová sklíčka, každé s malou kapkou fyziologického roztoku (nebo destilované vody) ve středu sklíčka za aseptických podmínek, s očkovacím kroužkem pro aseptické působení, v tomto pořadí, z Bacillus subtilis, Garcinia micrococcus a Escherichia coli šikmo, aby nabraly trochu mechu v kapce vody, promíchaly a pokryly filmem. Pokud se bakteriální suspenze (nebo tekutá kultura) rozmaže, lze použít k naočkování kroužku, vyberte 2 až 3 kroužky přímo na sklíčko. Všimněte si, že fyziologický roztok (destilovaná voda) a bakterie by neměly být příliš velké a měly by být rovnoměrně rozloženy, ne příliš husté.
5.2 Sušení Sušte přirozeně při pokojové teplotě. Lze jej také sušit zahřátím mírně nad alkoholovou lampou potaženou stranou nahoru. Nepřibližujte se však příliš blízko k plameni, protože příliš vysoká teplota zničí morfologii bakterií.
5.3 Fixace Pokud se použije sušení teplem, fixace a sušení se spojí do jednoho kroku stejným způsobem jako sušení. Namazat, vysušit a zahřát.
5.4 Barvení Položte sklíčko naplocho na polici sklíček, přidejte 1 až 2 kapky barvícího roztoku na nátěr (vhodné je, že barvící roztok pouze pokrývá stěrový film). Barvete nátěr Lü's Basic Mellanox Blue po dobu 1~2 min a Carbonate Red (nebo amonium oxalát Crystal Violet) po dobu asi 1 min.
5.5 Oplachování Barvicí roztok slijte a z jednoho konce sklíčka jemně opláchněte vodou z vodovodu, dokud voda stékající z nátěru nebude bezbarvá. Při oplachování nenechte vodu přímo stékat, abyste omyli natřený povrch. Proud vody by neměl být příliš rychlý nebo příliš velký, aby nedošlo k uvolnění mazacího filmu.
5.6 Sušení Kapky vody na podložním sklíčku setřeste, aby přirozeně uschly, vysušte fénem nebo k absorbování do sucha lze použít savý papír (pozor, neotřete tělo bakterií). 5.7 Mikroskopické vyšetření Nátěr se vysuší a zkoumá mikroskopicky. Před pozorováním olejovým mikroskopem musí být nátěr zcela suchý.
6 Výsledky Nakreslete morfologii E. coli a Micrococcus garciniae po jediném barvení.
Gram skvrna
1. Účel
1.1 Pochopit princip Gramova barvení a jeho význam při klasifikaci a identifikaci bakterií.
1.2 Naučit se a osvojit si techniku barvení podle Grama a upevnit učení se používání olejové čočky světelného mikroskopu.
