Principy fluorescenční mikroskopie
Fluorescenční mikroskopy se liší od běžných optických mikroskopů. Namísto pozorování vzorků pod osvětlením běžných světelných zdrojů používají světlo určité vlnové délky (obvykle ultrafialové světlo, modrofialové světlo) k excitaci fluorescenčních látek ve vzorcích pod mikroskopem, aby emitovaly fluorescenci. Světelný zdroj fluorescenčního mikroskopu tedy nefunguje jako přímé osvětlení, ale jako zdroj energie, který excituje fluorescenční látky ve vzorku. Důvod, proč můžeme pozorovat vzorek, je dán osvětlením světelného zdroje, ale fluorescenční jev prezentovaný poté, co fluorescenční látka ve vzorku absorbuje excitovanou světelnou energii.
Je vidět, že charakteristikou fluorescenčního mikroskopu je, že jeho světelný zdroj může dodávat velké množství excitačního světla v určitém rozsahu vlnových délek, takže fluorescenční látka v testovaném vzorku může získat excitační světlo potřebné intenzity. Zároveň musí mít fluorescenční mikroskop odpovídající filtrační systém.
Fluorescenční mikroskopie je základním nástrojem v imunofluorescenční histochemii. Skládá se z ultra-vysokonapěťového světelného zdroje, filtračního systému (včetně excitační a potlačovací filtrační desky), optického systému a fotografického systému a dalších hlavních komponent. Využívá světlo určité vlnové délky k excitaci vzorku, aby emitoval fluorescenci.
Způsob buzení fluorescence: Podle rozsahu vlnových délek světla ji lze rozdělit na dva typy: metodu UV excitace (pomocí metody ultrafialového osvětlení) a metodu BV excitace (použití modrofialového světla). Metoda UV excitace využívá k buzení blízké ultrafialové světlo kratší než 400 nm. V této metodě není žádné viditelné excitační světlo, takže pozorovaná fluorescence představuje inherentní fluorescenci barviva a je snadné odlišit specifickou fluorescenci na vzorku od autofluorescence tkáně pozadí.
BV excitační metoda je založena na 404nm a 434nm pro excitaci z ultrafialového na modré světlo. Tato metoda využívá k ozařování preparátu modré světlo, takže cut-off filtr fluorescenčního pozorovacího systému musí používat filtr, který dokáže zcela blokovat modré světlo a plně propustit požadovanou zelenou a žlutou fluorescenci. Fluorescenční barviva pro fluorescenční testy protilátek. Maximální vlnová délka absorpce excitačního světla je relativně blízká maximální emisní vlnové délce fluorescence, takže filtr použitý v BV excitační metodě musí používat ostrý cut-off filtr. Tato metoda může používat modré světlo jako excitační světlo, takže absorpční účinnost fluorescenčního pigmentu je vyšší a lze získat jasnější obraz. Jeho nevýhodou je, že fluorescence pod 500nm není vidět a fluorescence nad 500nm způsobuje, že celý obraz vypadá žlutě. Při metodě fluorescenční protilátky se specifičnost fluorochromu často posuzuje podle barvy jedinečné pro fluorochrom. Při diskuzi o jemné specifičnosti mají proto často velký vliv výše uvedené nedostatky BV excitační metody.
Suma sumárum, osvětlení fluorescenčního mikroskopu lze uvažovat podle následujících tří bodů podle struktury kondenzoru a vlnové délky excitačního světla.
① Z hlediska požadavků na kontrast fluorescenčního obrazu se pro osvětlení používá koncentrátor tmavého pole pro excitaci UV záření.
② S ohledem na jas obrazu má BV excitační filtr nejvyšší účinnost pozorování tmavého pole.
③Charakteristiky pozorování tmavého pole pomocí UV excitačního filtru a osvětlení pomocí koncentrátoru tmavého pole BV excitace lze považovat za mezi těmito dvěma způsoby osvětlení, ale první má silnější vlastnosti tmavého pole a zobrazuje jasnější obrazy. Kontrast je malý; ten si zachovává vlastnosti cesty světla v tmavém poli, takže zobrazený obraz je tmavší a kontrast je vylepšen. Při skutečném použití fluorescenčního mikroskopu by měla být pro pozorování použita metoda osvětlení, která nejlépe vyhovuje požadavkům vzorku.
Je třeba zdůraznit, že i když je osvětlen kondenzor tmavého pole buzený UV zářením s nejlepším kontrastem, část ultrafialového excitačního světla lomeného nebo rozptýleného vzorkem vstoupí do čočky objektivu. Autofluorescence může zhoršit odezvu obrazu. Proto musí být před okulárem jako ořezový filtr použit filtr pohlcující UV záření.
