Princip a strukturální vlastnosti fluorescenčních mikroskopů
Fluorescenční světelný zdroj obecně používá ultravysokotlakou rtuťovou výbojku (50–200 W), která vyzařuje světlo různých vlnových délek. Každá fluorescenční látka má však specifickou excitační vlnovou délku, která generuje intenzivní fluorescenci. Z tohoto důvodu je vyžadován excitační filtr (typicky dostupný v ultrafialovém, fialovém, modrém a zeleném typu), který umožní procházet a ozařovat vzorek pouze excitačnímu světlu určité vlnové délky, zatímco absorbuje všechny ostatní vlnové délky.
Při ozařování excitačním světlem emituje každá látka během extrémně krátké doby viditelnou fluorescenci s delší vlnovou délkou než excitační světlo. Fluorescence je vysoce specifická a obecně slabší než excitační světlo. Pro pozorování této specifické fluorescence musí být za čočkou objektivu nainstalován bariérový (nebo supresivní) filtr. Slouží ke dvěma účelům: za prvé absorbuje a blokuje excitační světlo pronikající do okuláru, aby se zabránilo rušení fluorescenčního pozorování a poškození očí; za druhé, selektivně přenáší specifickou fluorescenci, aby vytvořila zřetelnou fluorescenční barvu. Musí být vybrány dva typy filtrů a použity v odpovídajících párech.
Fluorescenční mikroskopy jsou rozděleny do dvou typů na základě jejich optické dráhy:
1. Fluorescenční mikroskop s procházejícím světlem
V tomto provedení zdroj excitačního světla prochází kondenzátorem a materiálem vzorku, aby excitoval fluorescenci. Běžně se používá kondenzátor s tmavým polem, i když lze použít i standardní kondenzátor; odrazné zrcadlo je nastaveno tak, aby přesměrovalo a bočně ozařovalo excitační světlo na vzorek. Jedná se o relativně starší typ fluorescenčního mikroskopu. Jeho výhodou je silná fluorescence při malém zvětšení, zatímco jeho nevýhodou je, že se zvyšujícím se zvětšením intenzita fluorescence klesá. Je proto vhodnější pro pozorování větších vzorků materiálů.
2. Epifluorescenční mikroskop
Jedná se o moderní, nově vyvinutý typ fluorescenčního mikroskopu. Na rozdíl od konstrukce procházejícího světla je excitační světlo promítáno dolů přes čočku objektivu na povrch vzorku - stejná čočka objektivu slouží jako osvětlovací kondenzor i jako objektiv sbírající fluorescenci. Dichroický dělič paprsků je instalován v optické dráze pod úhlem 45 stupňů k optické ose. Budící světlo se odráží do čočky objektivu a zaostřuje na vzorek. Fluorescence generovaná vzorkem spolu s excitačním světlem odraženým od povrchů čočky objektivu a krycího sklíčka současně vstupuje do čočky objektivu a vrací se do dichroického rozdělovače paprsků, který odděluje excitační světlo od fluorescence. Zbývající excitační světlo je pak absorbováno bariérovým filtrem.
Záměnou filtračních bloků s různými kombinacemi excitačního filtru, dichroického rozdělovače paprsků a bariérového filtru lze splnit požadavky na různé produkty fluorescenční reakce. Mezi výhody tohoto typu fluorescenčního mikroskopu patří rovnoměrné osvětlení pole, ostré zobrazení a zvýšení intenzity fluorescence při větším zvětšení.
