Učebna mikroskopického zobrazování – širokoúhlý fluorescenční mikroskop
V aplikacích zobrazování živých buněk usnadňuje širokoúhlá fluorescenční mikroskopie pozorování dynamiky adherentních buněk rostoucích ve specifických komorách prostředí umístěných na stolku mikroskopu. Ve své nejzákladnější konfiguraci je standardní invertovaný mikroskop pro tkáňové kultury vybavený fluorescenčním osvětlením EPI spojen se systémem plošného pole detektoru (obvykle CCD kamera), vhodnými fluorescenčními filtry a systémem závěrky pro omezení nadměrné expozice buněk škodlivému excitačnímu světlu. . Základní fluorescenční mikroskopie spoléhá na pečlivě přizpůsobené interferenční filtry pro výběr specifických šířek pásma pro osvětlení a detekci emitovaného světla. Světelné zdroje zahrnují rtuťové, xenonové a halogenidové výbojky, laserové systémy rozšiřující paprsek a světelné diody (LED), z nichž všechny vyžadují různé specifikace filtrů. Syntetické fluorofory používané ve fluorescenční mikroskopii mají emisní spektra pokrývající blízkou ultrafialovou, viditelnou a blízkou infračervenou oblast. Použití geneticky kódovaných fluorescenčních proteinů značně rozšířilo možnosti fluorescenční mikroskopie při zobrazování živých buněk, což umožňuje výzkumníkům přesně zacílit subcelulární oblasti zájmu.
Nuohai LS 18, nový typ osvětlovacího mikroskopu se světelnou vrstvou nezávisle vyvinutý společností Nuohai, je speciálně navržen pro 3D zobrazování průhledných vzorků velké tkáně s vysokým rozlišením a je určen pro zkoumání různých neporušených tkání, jako je mozek, slezina, tenké střevo. ledvin, plic, srdce a nádoru. 3D přesná struktura orgánů.
Při fluorescenci s širokým polem maximalizuje emise s plnou aperturou shromážděná objektivem mikroskopu zaznamenaný signál a zároveň minimalizuje požadovaný expoziční čas. Vzorky tak mohou být zobrazeny s velmi krátkými světelnými periodami. Hlavní nevýhodou širokoúhlého zobrazování je to, že fluorescence z oblastí vzdálených od ohniskové roviny, stejně jako signál pozadí, je nežádoucí světlo, které často zakrývá zajímavé rysy. Širokoúhlé zobrazování tedy poskytuje nejlepší výsledky, když jsou zajímavé znaky velké (jako jsou organely) nebo vysoce tečkovité. Široká škála vzorků živých buněk, včetně adherentních buněk, bakterií, kvasinek a velmi tenkých tkáňových řezů, jsou ideálními kandidáty pro širokoúhlé fluorescenční zobrazování, nicméně tlustší tkáně (nad 5 mikronů) se nejlépe používají s pokročilejší metodou zobrazování.
Ačkoli došlo k mnoha pokrokům ve fluorescenčním zobrazování se syntetickými fluorescenčními barvivy, kvantovými tečkami a fluorescenčními proteiny, v některých případech je užitečné kombinovat fluorescenci s jinými zobrazovacími modalitami. Jako příklad lze DIC použít ve spojení s fluorescencí se širokým polem k monitorování buněčné životaschopnosti a obecné morfologie při studiu jevů zájmu pro specifické značené cíle. Získání DIC a fluorescence v jediném snímku je obvykle nepraktické, ale ve správně nakonfigurovaném mikroskopu lze tyto dvě techniky použít postupně. Po zobrazení v epifluorescenčním režimu lze tedy získat DIC obrazy z fluorescenčně značených vzorků pomocí procházejícího světla. Tyto dva obrázky lze sloučit během následné analýzy. Současné získávání DIC a fluorescenčních obrazů je možné v pokročilých konfiguracích širokoúhlých mikroskopů pomocí spektrálně odděleného osvětlení (jako je viditelné a blízké infračervené) a adaptérů pro kamery se dvěma kamerami nebo s děleným pohledem. Ve většině laserových skenovacích konfokálních mikroskopů lze snímky pořizovat současně ve fluorescenčním i DIC režimu, což eliminuje potřebu následného zpracování. Fázový kontrast a Hoffmanův modulační kontrast lze také použít ve spojení s širokoúhlou fluorescenční mikroskopií. V těchto technikách je však čočka objektivu speciální, ať už jde o fázový prstenec nebo Hoffmanovu modulační desku, způsobí ztrátu intenzity vyzařování o 5-15 procent.
Odkaz na článek: Instrument Equipment Network https://www.instrumentsinfo.com/technology/show-1123.html
