Vlastnosti a aplikace laserového konfokálního mikroskopu
Zatímco v normálním mikroskopu je obrazová rovina pozorování izolována od sousedních axiálních rovin překrytím ohniskové roviny čočky objektivu s detektorem, v konfokálním mikroskopu je této izolace dosaženo osvětlením vzorku bodem omezujícím difrakci světlo a filtrování rozptýleného světla pomocí dírky v dráze shromážděného světla v konjugovaném ohnisku tohoto světelného bodu k dosažení této izolace a tím ke zlepšení rozlišení.
Pouze světlo odražené zpět od vrstvy konjugovaného vzorku může procházet dírkou v dráze sběrného světla, zatímco zbytek irelevantních odrazů vrstvy vzorku je blokován dírkou. To poskytuje výrazné zvýšení rozlišení. Níže je ukázáno vedle sebe srovnání vícerozměrné fluorescenční mikroskopie a konfokální mikroskopie stejného tlustého vzorku. Když se pořídí série snímků v různých ohniskových rovinách, vytvoří se snímek běžně označovaný jako "z-stack", který ukazuje zisky rozlišení a kontrastu poskytované konfokální mikroskopií a základní důvody těchto zisků. Je vidět, že zkoumání obrazu v horní části zásobníku, kde je zobrazovací rovina nad tkání, odhaluje velké množství rozptýleného světla ve fluorescenčním obrazu, zatímco obraz z konfokálního mikroskopu se zdá černý. Toto snížení PSF v axiálním směru přímo přispívá k rozdílu v rozlišení pozorovaném na optickém rozhraní uprostřed z-souboru.
Optické skenování řezů
Dalším rysem laserové skenovací konfokální mikroskopie je, že se jedná o skenovací zobrazovací techniku. Tradiční širokoúhlé osvětlovací techniky osvětlují celý vzorek, takže obraz lze zachytit přímo pouhým okem nebo detektorem, ale LSCM používá jeden nebo více zaostřených paprsků světla ke skenování skrz vzorek, takže výsledný obraz se nazývá optický řez, jak je znázorněno na následujícím obrázku. Rozdíl mezi tradičním širokoúhlým osvětlením a laserovým skenovacím konfokálním osvětlením je znázorněn níže.
Na obrázku níže je proto znázorněn praktický způsob moderní konfokální mikroskopie. Excitační světlo z laseru prochází dichroickým zrcadlem a snímá se přes dvojici zrcadel galvanometru ve směru x a y vzorku a excitace (nebo odraz) vzorku prochází dírkou do PMT detektor, který se má zaznamenat, a zaznamenaný naskenovaný obraz je rekonstruován počítačem za účelem vytvoření skutečného obrazu vzorku.
