Znalosti související s konfokální fluorescenční mikroskopií
Základním principem konfokální fluorescenční mikroskopie je použití bodového zdroje světla k ozařování preparátu, čímž se v ohniskové rovině vytvoří dobře definovaná malá skvrna. Fluorescence emitovaná skvrnou po ozáření je sbírána čočkou objektivu a posílána zpět do spektrofotometru složeného z obousměrného barevného zrcadla podél původní dráhy ozáření. Spektrofotometr vysílá fluorescenci přímo do detektoru. Před zdrojem světla a detektorem jsou dvě dírky, které se nazývají dírky osvětlení a dírky detekce. Geometrické rozměry obou jsou konzistentní, přibližně 100-200nm; Ve srovnání se světelným bodem v ohniskové rovině jsou oba sdružené, což znamená, že světelný bod prochází řadou čoček a může se nakonec soustředit jak na osvětlovací dírku, tak na detekční dírku současně. Tímto způsobem se světlo z ohniskové roviny může sbíhat v dosahu detekčního otvoru, zatímco rozptýlené světlo nad nebo pod ohniskovou rovinou je blokováno mimo detekční otvor a nelze jej zobrazit. Skenováním vzorku bod po bodu laserem získá trubice fotonásobiče po detekci dírky také odpovídající konfokální obraz světelného bodu bod po bodu, který je převeden na digitální signál a přenesen do počítače. Nakonec je na obrazovce syntetizován jasný konfokální obraz celé ohniskové roviny.
Každý snímek ohniskové roviny je ve skutečnosti optickým řezem preparátem, který má vždy určitou tloušťku, také známou jako optický tenký řez. Vzhledem k tomu, že intenzita světla v ohnisku je mnohem větší než v neohniskovém bodě a světlo mimo ohniskové roviny je odfiltrováno dírkami, je hloubka ostrosti konfokálního systému přibližně nulová. Skenováním ve směru osy Z lze dosáhnout optické tomografie, která vytvoří dvourozměrný optický řez v ohnisku pozorovaného vzorku. Kombinací skenování v rovině XY (ohnisková rovina) se skenováním v ose Z (optická osa) lze získat trojrozměrný obraz vzorku akumulací souvislých vrstev dvourozměrných obrazů a jejich zpracováním pomocí specializovaného počítačového softwaru.
Detekční dírka a dírka světelného zdroje jsou vždy zaostřeny na stejný bod, takže fluorescence excitovaná mimo ostřící rovinu nemůže vstoupit do detekční dírky.
Jednoduchým vyjádřením pracovního principu laserové konfokální mikroskopie je, že jako zdroj světla využívá laser a přidává laserové skenovací zařízení a konjugované zaostřovací zařízení na bázi tradičního zobrazování pomocí fluorescenční mikroskopie. Jde o systém řízený počítačem pro digitální pořizování a zpracování obrazu.
