Znalosti o dvou{0}}fotonové fluorescenční mikroskopii
Základní princip dvou{0}}excitace fotonů spočívá v tom, že při vysoké hustotě fotonů mohou fluorescenční molekuly současně absorbovat dva fotony s dlouhou vlnovou délkou a po krátké době života v takzvaném -excitovaném stavu emitovat foton s kratší vlnovou délkou; Účinek je stejný jako při použití fotonu s poloviční vlnovou délkou dlouhé vlnové délky k excitaci fluorescenčních molekul. Dvoufotonová excitace vyžaduje vysokou hustotu fotonů, a aby nedošlo k poškození buněk, používá dvou{3}}fotonová mikroskopie vysoce{4}}energetické-uzavřené pulzní lasery. Laser emitovaný tímto laserem má vysokou špičkovou energii a nízkou průměrnou energii, s šířkou pulsu pouze 100 femtosekund a frekvencí až 80 až 100 megahertzů. Při použití čočky objektivu s vysokou numerickou aperturou k zaostření fotonů pulzního laseru je hustota fotonů v ohnisku čočky objektivu nejvyšší a k excitaci dvou fotonů dochází pouze v ohnisku čočky objektivu. Dvoufotonový mikroskop proto nevyžaduje konfokální dírku, což zlepšuje účinnost fluorescenční detekce.
V obecných fluorescenčních jevech může fluorescenční molekula v důsledku nízké hustoty fotonů excitačního světla absorbovat pouze jeden foton najednou a poté emitovat další fluorescenční foton prostřednictvím radiačního přechodu, který je známý jako fluorescence jednoho fotonu. U fluorescenčních excitačních procesů využívajících jako světelných zdrojů lasery se může vyskytnout dvoufotonový nebo dokonce vícefotonový fluorescenční fenomén. V tomto případě má použitý zdroj excitačního světla vysokou intenzitu a hustotu fotonů, která splňuje požadavek, aby fluorescenční molekuly absorbovaly dva fotony současně. V procesu použití obecného laseru jako zdroje excitačního světla je hustota fotonů stále nedostatečná k vytvoření jevu dvou-fotonové absorpce. Typicky se používají femtosekundové pulzní lasery s okamžitým výkonem dosahujícím úrovně megawattů. Vlnová délka dvoufotonové fluorescence je proto kratší než vlnová délka excitačního světla, což je ekvivalentní efektu vyvolanému excitací poloviční excitační vlnovou délkou.
