Znalosti o konfokální fluorescenční mikroskopii
Základní princip konfokální fluorescenční mikroskopie: k ozáření preparátu se používá bodový světelný zdroj a na ohniskové rovině se vytvoří dobře definovaná malá světelná skvrna. složený ze štípaček. Dělič paprsku posílá fluorescenci přímo do detektoru. Před světelným zdrojem a detektorem je dírka, která se nazývá dírka osvětlení a detekční dírka. Geometrická velikost obou je stejná, asi 100-200nm; vzhledem ke světelné skvrně na ohniskové rovině jsou tyto dvě konjugované, to znamená, že světelná skvrna prochází řadou čoček a nakonec může být zaostřena na osvětlovací dírku a detekční dírku současně. Tímto způsobem se světlo z ohniskové roviny může sbíhat v rámci detekčního otvoru, zatímco rozptýlené světlo nad nebo pod ohniskovou rovinou je blokováno mimo detekční otvor a nelze jej zobrazit. Laser skenuje vzorek bod po bodu a trubice fotonásobiče po detekci dírky také získá konfokální obraz odpovídajícího světelného bodu bod po bodu, který je převeden na digitální signál a přenesen do počítače a nakonec agregován do čistého konfokální obraz celé ohniskové roviny na obrazovce.
Každý snímek ohniskové roviny je ve skutečnosti optickým řezem preparátem a tento optický řez má vždy určitou tloušťku, také známou jako optický tenký řez. Protože intenzita světla v ohnisku je mnohem větší než v nezaostřeném bodě a světlo v neohniskové rovině je filtrováno dírkou, je hloubka pole konfokálního systému přibližně nulová a skenování podél Z -axis může realizovat optickou tomografii, tvořící pozorování dvourozměrného optického řezu na zaostřeném místě vzorku. Kombinací skenování v rovině XY (ohnisková rovina) se skenováním v ose Z (optická osa) lze získat trojrozměrný obraz vzorku akumulací dvourozměrných obrazů spojitých vrstev a zpracovat speciálním počítačovým softwarem.
