Zlepšení Výhody laserové skenovací multifotonové mikroskopie
Laserová skenovací multifotonová mikroskopie představuje hlavní pokrok v optické mikroskopii. Umožňuje pozorování hlubokých struktur v živých buňkách, fixovaných buňkách a tkáních a zároveň zachycuje jasné a ostré vícevrstvé struktury v rovině Z – jmenovitě optické řezy – které lze dále použít k rekonstrukci trojrozměrné pevné struktury vzorků.
Konfokální mikroskop využívá laserový zdroj světla. Laserový paprsek se rozšíří tak, aby plně osvětlil zadní ohniskovou rovinu čočky objektivu, poté prochází systémem čoček objektivu a konverguje do extrémně malého bodu v ohniskové rovině preparátu. V závislosti na numerické apertuře čočky objektivu se průměr osvětlovaného bodu pohybuje přibližně od 0,25 do 0,8 μm, s axiální hloubkou asi 0,5 až 1,5 μm. Velikost konfokální skvrny je dána konstrukcí mikroskopu, vlnovou délkou laseru, charakteristikami objektivu, nastavením skenovací jednotky a vlastnostmi vzorku.
Širokoúhlé mikroskopy se vyznačují velkým rozsahem osvětlení a hlubokou hloubkou osvětlení, zatímco konfokální mikroskopie soustřeďuje osvětlení do přesného ohniska v ohniskové rovině. Hlavní výhoda konfokální mikroskopie spočívá v její schopnosti provádět jemné optické řezy na silných fluorescenčních vzorcích (až 50 μm nebo více), přičemž tloušťka každého řezu se pohybuje od 0,5 do 1,5 μm.
Série obrazů optických řezů se získá vertikálním pohybem vzorku přes přesný krokový motor v ose Z mikroskopu. Sběr obrazového signálu je přísně omezen na cílovou ohniskovou rovinu a není rušen signály pocházejícími z jiných pozic ve vzorku. Po odstranění fluorescence pozadí a zlepšení poměru signálu k šumu vykazují konfokální snímky výrazně vyšší kontrast a rozlišení ve srovnání s tradičními fluorescenčními snímky se širokým polem.
U většiny vzorků se složité konstrukční komponenty prolínají a vytvářejí složité systémy. Jakmile je nasbírán dostatečný počet optických řezů, lze pomocí profesionálního softwaru dokončit trojrozměrnou rekonstrukci. Tato experimentální metoda byla široce používána v biologickém výzkumu k objasnění složitých strukturních a funkčních vztahů mezi buňkami a tkáněmi.
