Jak vybrat vhodný fluorescenční mikroskop
Fluorescenční mikroskop je standardní mikroskopické zobrazovací zařízení v laboratořích a patologických odděleních, které využívá fluorescenční charakteristiky pro pozorování a zobrazování. Je široce používán v různých oblastech, jako je buněčná biologie, neurobiologie, botanika, mikrobiologie, patologie, genetika atd. Fluorescenční zobrazování má výhody vysoké citlivosti a specifičnosti, díky čemuž je velmi vhodné pro pozorování distribuce specifických proteinů, organel atd. .
Výběr mikroskopů
Fluorescenční mikroskopy se dělí především do tří kategorií: vertikální fluorescenční mikroskopy (vhodné pro krájení), invertované fluorescenční mikroskopy (vhodné pro živé buňky i pro krájení) a stereo fluorescenční mikroskopy (vhodné pro větší vzorky, jako jsou rostliny, zebričky (dospělé/ embryonální), medaka, orgány myší/krys atd.).
Výběr fluorescenčních filtračních bloků
Výběr filtračních bloků by neměl brát v úvahu pouze excitační a emisní vlnové délky fluorescenčních sond, ale také zvážit, zda dochází k nespecifické excitaci a zda existuje barevný přeslech u vícebarevně značených vzorků. V experimentu zvolíme pro buzení vlnovou délku co nejblíže k excitačnímu vrcholu a přijímací rozsah by měl zahrnovat špičkovou emisi. Excitační pík Alexa Fluor 488 je 500nm a ve fluorescenčním mikroskopu lze vybrat excitační filtr 480/40. Běžně používané fluorescenční filtrační bloky ve fluorescenční mikroskopii lze rozdělit do dvou typů: dlouhý průchod (LP) a pásmový průchod (BP), které je také potřeba vybrat podle potřeb.
Konfokální mikroskop
Při tradičních pozorováních fluorescenční mikroskopií jsou kvůli překrývání fluorescenčně značených látek a spontánních fluorescenčních struktur spolu těsně spojeny. Tradiční padající fluorescenční mikroskopické objektivy však nejen shromažďují světlo z ohniskové roviny, ale také rozptylují světlo nahoru a dolů po ohniskové rovině, což má za následek výrazné snížení rozlišení a kontrastu obrazu.
Konfokální zobrazování detekuje pouze světlo odražené od roviny automatického zaostřování, čímž řeší výše uvedený problém. Světelný zdroj tvoří malou a jemnou skvrnu na ohniskové rovině skrz dírku a světlo vyzařované z ohniskové roviny je shromažďováno přes čočku objektivu. Většina fluorescence vyzařované z bodů nad nebo pod ohniskovou rovinou čočky objektivu nemůže konvergovat k dírce. Dírkou může procházet pouze fluorescence umístěná v ohniskové rovině a malá část rozostřené fluorescence, zatímco světelný paprsek mimo ohniskovou rovinu se sbíhá před nebo za dírkovou destičkou a je blokován, aby nepronikl do detektoru dírkou. Detekovaný obraz je z ohniskové roviny, takže výsledná kvalita obrazu je výrazně zlepšena.
Vzhledem k různým výhodám a praktičnosti laserové skenovací konfokální mikroskopie je v současné době nepostradatelným experimentálním pomocníkem v oblasti vysoce přesné buněčné biologie, botaniky a buněčného výzkumu. Zároveň bude v budoucích vědeckovýzkumných centrech nejzákladnějším a nejzákladnějším výzkumným nástrojem.
