Jak se pozoruje morfologie mikrobiálních buněk pod mikroskopem?
Mikroskopy byly vynalezeny, aby viděly usmívající se předměty, které nelze vidět pouhým okem. Mikroorganismy jsou velmi malé, proto je nutné je zvětšovat a pozorovat pomocí mikroskopu. Kromě toho existuje mnoho druhů mikroorganismů, takže v podstatě většina optických mikroskopů dokáže mikroorganismy pozorovat. Další otázkou je, jaký typ mikroskopu by měl být použit pro pozorování a analýzu jakých mikroorganismů. Mezi běžné mikroskopy, které lze použít k pozorování mikrobiální morfologie, patří biologické mikroskopy, mikroskopy s fázovým kontrastem, inverzní mikroskopy, fluorescenční mikroskopy, konfokální mikroskopy atd.
Níže jsou popsány různé mikroskopy používané k pozorování mikroorganismů:
1. Běžný optický mikroskop využívá přirozené světlo nebo světlo jako zdroj světla a jeho vlnová délka je asi 0,4 μm. Rozlišení mikroskopu je jedna polovina vlnové délky, tedy 0,2 μm, a nejmenší obraz viditelný pouhým okem je 0,2 mm. Proto použití olejového (ponorného) zrcátka ke zvětšení 1000krát může zvětšit částice o velikosti 0,2 μm na 0,2 mm viditelné pouhým okem. Pro pozorování bakterií, aktinomycet a hub lze použít běžné optické mikroskopy.
2. Mikroskopie v temném poli se běžně používá k pozorování nezbarvené mikrobiální morfologie a pohybu. Po instalaci kondenzoru tmavého pole do běžného mikroskopu nemůže světlo pronikat přímo ze středu a zorné pole je tmavé. Když vzorek dostane šikmé světlo z okraje kondenzoru, může se rozptýlit, takže na pozadí tmavého pole lze pozorovat jasné mikroorganismy, jako jsou bakterie nebo spirochety.
3. Mikroskop s fázovým kontrastem Mikroskop s fázovým kontrastem využívá světelný efekt destičky s fázovým rozdílem ke změně fáze světla a amplitudy přímého světla a přeměně rozdílu fáze světla na rozdíl intenzity světla. Pod mikroskopem s fázovým kontrastem, když světlo prochází neobarveným preparátem, je rozdíl ve světelné fázi způsoben nekonzistencí hustoty různých částí preparátu a lze pozorovat morfologii, vnitřní strukturu a způsob pohybu mikroorganismů.
4. Fluorescenční mikroskop Fluorescenční mikroskop je v podstatě stejný jako běžný optický mikroskop, hlavním rozdílem je zdroj světla, filtr a kondenzor. V současnosti většina z nich využívá epi-světelné přístroje a jako zdroje světla se běžně používají vysokotlaké rtuťové výbojky, které mohou vyzařovat ultrafialové nebo modrofialové světlo. Existují dva druhy filtrů: excitační filtr a absorpční filtr. Kromě obecných kondenzorů se světlým polem lze ve fluorescenčních mikroskopech používat také kondenzory pro tmavé pole využívající modré světlo ke zvýšení kontrastu mezi fluorescencí a pozadím. Tato metoda je použitelná pro detekci nebo identifikaci bakterií obarvených fluorescenčními pigmenty nebo kombinovaných s fluorescenčními protilátkami.
5. Elektronové mikroskopy využívají jako zdroj světla tok elektronů a vlnová délka je desetitisíckrát odlišná od viditelného světla, což výrazně zlepšuje rozlišení. Používá také magnetickou cívku jako systém optického zesílení a zvětšení může dosáhnout desetitisíců nebo stovek tisíckrát. Často se používá pro pozorování virových částic a bakteriální ultrastruktury.
Pozorování nebarvených mikrobiálních vzorků:
Neobarvené vzorky lze obecně použít k pozorování bakteriální morfologie, síly a pohybu. Bakterie jsou bez obarvení bezbarvé a průhledné a pod mikroskopem je lze pozorovat především podle rozdílu mezi indexem lomu bakterií a okolním prostředím. Bakterie s bičíky se energicky pohybují, zatímco bakterie bez bičíků vykazují nepravidelný Brownův pohyb. Životaschopné bakterie jako Treponema pallidum, Leptospira a Campylobacter mají charakteristické tvary a pohybové vzorce, které mají diagnostický význam. Běžně používané metody jsou metoda tlakové ztráty, metoda pendantní kapky a kapilární metoda.
1. Naneste vazelínu kolem konkávního otvoru čistého konkávního skla metodou závěsné kapky, pomocí očkovací smyčky odeberte kroužek bakteriální suspenze a umístěte jej do středu krycího skla, poté vyrovnejte konkávní otvor konkávního skla s kapku do středu krycího skla a zakryjte ji, pak ji rychle otočte, lehce na krycí sklo zatlačte, aby se těsně přilepilo k vazelíně na okraji konkávního otvoru, a pozorujte pod mikroskopem s velkým zvětšením (resp. tmavé pole).
2. Vezměte kroužek bakteriální suspenze s očkovací smyčkou a umístěte jej do středu čistého podložního sklíčka metodou tlakové ztráty a opatrně zakryjte bakteriální suspenzi krycím sklem, dávejte pozor, abyste zabránili bublinám a přetečení bakteriální suspenze. . Po několika sekundách nehybnosti pozorujte pod vysoce výkonným mikroskopem ve světlém (nebo tmavém poli).
3. Kapilární metoda se používá především pro vyšetření kinetiky anaerobních bakterií. Obvykle zvolte délku 60~70mm. Po odsátí suspenze anaerobních bakterií kapilárou s otvorem 0.5-1,0 mm utěsněte oba konce kapiláry plamenem. Kapilára byla upevněna na podložní sklíčko plastovým papírem a pozorována pod vysoce výkonnou čočkou v tmavém poli.
Pozorování obarvených mikrobiálních vzorků mikroskopem:
Poté, co je bakteriální vzorek obarven, díky ostrému barevnému kontrastu mezi bakteriemi a okolním prostředím, morfologické vlastnosti bakterií (jako je velikost, tvar, uspořádání atd.) bakterií a některé speciální struktury (např. jako tobolky, bičíky, spory atd.) lze jasně pozorovat pod běžným optickým mikroskopem a bakterie lze klasifikovat a identifikovat podle reaktivity barvení.
(1) Obecný postup barvení bakterií Obecný postup barvení bakterií je: nátěr (sušení)—fixace—barvení.
1. Stěr Příprava krve, sekretů, exkrecí, punkční tekutiny a tekuté kultury a přímé stěry z tenkého filmu na podložní sklíčka; pitvu nebo infikované zvířecí tkáně, potřete lézi vatovým tamponem pro odběr vzorků. Pro přípravu bakteriálních kolonií nebo trávníků na pevném médiu nejprve pomocí očkovací kličky odeberte kroužek normálního fyziologického roztoku a vložte jej do středu podložního sklíčka, poté pomocí sterilní očkovací kličky odeberte malé množství kultury a rozemlejte rovnoměrně v normálním fyziologickém roztoku, rozetřete na 1 cm2 potaženou plochu a nechte přirozeně uschnout při pokojové teplotě nebo pomalu schnout na dálku.
2. Účelem fixace je zabít bakterie, koagulovat bakteriální protein a strukturu a usnadnit barvení; podporovat přilnavost bakterií na sklíčko, aby nedošlo k jejich smytí vodou během mytí; změnit propustnost bakterií pro barviva, což je výhodné pro barvení bakteriálních intracelulárních struktur. Fixuje se většinou zahřátím plamenem a zaschlý maz se rychle 3x protáhne plamenem. Kůži na hřbetu ruky si při dotyku sklíčka raději nespálíte.
3. Barvení Podle různých kontrolních účelů zvolte pro barvení různé metody barvení. Při barvení přidávejte roztok barviva po kapkách, abyste zvýšili krytí.
4. Mořidlo Jakákoli látka, která může zvýšit afinitu mezi barvivem a barveným předmětem, fixovat barvivo na barveném předmětu a způsobit změnu propustnosti buněčné membrány, se nazývá mořidlo. Běžně se používá kamenec, kyselina tříslová, soli kovů a jód atd., k podpoře vybarvení se také používá zahřívání. Mořidla mohou být použita mezi primárním barvením a kontrastním barvením a mohou být také použita po fixaci nebo obsažena ve fixativu a barvení.
5. Odbarvování Jakékoli chemické činidlo, které dokáže odstranit barvu barveného předmětu, se nazývá odbarvovač. Ethanol, aceton atd. se běžně používají jako odbarvovače. Odbarvovací činidlo dokáže detekovat stupeň stability kombinace bakterií a barviv, které lze použít pro diferenciální barvení.
6. Kontrastní barvení Bakterie nebo jejich struktury, které byly odbarveny, jsou často barveny kontrastním roztokem pro snadné pozorování. Barva kontrastního barvícího roztoku se liší od barvy primárního barvícího roztoku pro vytvoření ostrého kontrastu. Kontrastní barvení by nemělo být příliš silné, aby nepřekrylo barvu původního barvení.
