Princip aplikace a použití fluorescenčního mikroskopu
(1) Princip a strukturální vlastnosti fluorescenčního mikroskopu: fluorescenční mikroskop používá bodový světelný zdroj s vysokou světelnou účinností k vyzařování světla o určité vlnové délce (jako je ultrafialové světlo 3650 palců nebo fialové modré světlo 4200 palců) přes filtrační systém jako excitační světlo k vybuzení vzorku. Poté, co fluorescenční látka uvnitř emituje fluorescenci různých barev, je pozorována prostřednictvím zvětšení čočky objektivu a okuláru. Tímto způsobem, pod silným kontrastním pozadím, i když je fluorescence velmi slabá, je snadno identifikovatelná a má vysokou citlivost. Používá se především pro výzkum buněčné struktury a funkce a chemického složení. Základní konstrukce fluorescenčního mikroskopu se skládá z běžného optického mikroskopu a některého příslušenství (jako je zdroj fluorescenčního světla, excitační filtr, dvoubarevný dělič paprsků a blokovací filtr atd.). Fluorescenční zdroj světla – obecně se používá ultra vysokotlaká rtuťová výbojka (50-200W), která může vyzařovat světlo různých vlnových délek, ale každá fluorescenční látka má excitační vlnovou délku, která produkuje nejsilnější fluorescenci, takže excitační filtr ( Obecně platí, existují ultrafialové, fialové, modré a zelené excitační filtry), které propouštějí pouze excitační světlo určité vlnové délky a ozařují vzorek, zatímco jiné světlo pohlcují. Každá látka je po ozáření excitačním světlem ve velmi krátké době emitována viditelnou fluorescencí s delší vlnovou délkou, než je vlnová délka ozařování. Fluorescence je specifická a obecně slabší než excitační světlo. Aby bylo možné pozorovat specifickou fluorescenci, je zapotřebí blokovací (nebo potlačující) filtr za čočkou objektivu. Má dvě funkce: jednou je absorbovat a blokovat vstup excitačního světla do okuláru, aby nedošlo k narušení fluorescence a poškození očí; druhým je vybrat a nechat projít specifickou fluorescenci, která ukazuje specifickou fluorescenční barvu. Oba filtry se musí používat společně.
Existují dva typy fluorescenčních mikroskopů z hlediska jejich optických drah:
1. Transmisní fluorescenční mikroskop: Zdroj excitačního světla prochází materiálem vzorku přes kondenzorovou čočku, aby se excitovala fluorescence. Běžně se používá kolektor tmavého pole a obyčejný kolektor lze použít i k nastavení zrcadla tak, aby bylo excitační světlo přesměrováno a přemostěno na preparát. Jedná se o starší fluorescenční mikroskop. Výhodou je, že fluorescence je silná při malém zvětšení, ale nevýhodou je, že fluorescence klesá s rostoucím zvětšením. Proto je lepší pozorovat větší vzorky materiálů.
2. Epi-fluorescenční mikroskop je nový typ fluorescenčního mikroskopu vyvinutý v moderní době. Rozdíl je v tom, že excitační světlo dopadá z čočky objektivu na povrch preparátu, to znamená, že stejná čočka objektivu se používá jako osvětlovací kondenzor a čočka objektivu pro sběr fluorescence. Ve světelné dráze, která je vzdálena 45 stupňů od lehkého uranu, je třeba přidat dichroický dělič paprsku. Budící světlo se odráží do čočky objektivu a shromažďuje se na vzorku. Fluorescence generovaná vzorkem a excitační světlo odražené povrchem čočky čočky objektivu a povrchem krycího skla vstupují do čočky objektivu současně a vracejí se do dvoubarevného rozdělovače paprsku, aby se excitační světlo oddělilo od fluorescence , zbytkové excitační světlo je absorbováno blokovacími filtry. Například přechod na kombinaci různého excitačního filtru/dvoubarevného děliče paprsku/blokovacího filtru může splňovat potřeby různých produktů fluorescenční reakce. Výhodou tohoto typu fluorescenčního mikroskopu je, že osvětlení zorného pole je rovnoměrné, zobrazení je jasné a čím větší zvětšení, tím silnější fluorescence.
(2) Jak používat fluorescenční mikroskop.
1. Zapněte zdroj světla a ultravysokotlaká rtuťová výbojka se musí několik minut zahřát, aby dosáhla nejjasnějšího bodu.
2. Transmisní fluorescenční mikroskop potřebuje nainstalovat požadovaný excitační filtr mezi zdroj světla a kondenzor a za čočku objektivu nainstalovat odpovídající blokovací filtr. Epifluorescenční mikroskopy potřebují vložit požadovaný excitační filtr/dvoubarevný dělič paprsků/blokovací filtr do štěrbin ve světelné dráze.
3. Pozorujte čočkou s malým zvětšením a upravte střed světelného zdroje tak, aby se nacházel ve středu celého osvětlovacího bodu podle seřizovacího zařízení různých modelů fluorescenčních mikroskopů.
4. Umístěte vzorek a po zaostření pozorujte. Při používání je třeba věnovat pozornost: nepozorujte přímo koncový filtr, abyste nepoškodili zrak; při pozorování preparátů olejovou čočkou je nutno použít speciální olejovou čočku bez fluorescence; po zhasnutí vysokotlaké rtuťové výbojky nelze ihned znovu zapnout, je třeba ji vyzkoušet. Po 5 minutách ji lze restartovat, jinak bude nestabilní a ovlivní životnost rtuťové výbojky.
(3) Pozorujte buňky obarvené fluorescenčním barvivem 0,01 procenta akridinově oranžové pod fluorescenčním mikroskopem na výukové platformě s filtrem modrofialového světla. Jádro a cytoplazma jsou excitovány, aby produkovaly dvě různé barvy fluorescence (tmavě zelená a oranžově červená).
