Vlastnosti a aplikace konfokální laserové mikroskopie
Laserový skenovací konfokální mikroskop (LSCM) je typ mikroskopu navržený na základě technologie konjugovaného zaostřování, to znamená, že zdroj laserového světla, testovaný vzorek a detektor jsou všechny ve vzájemné konjugované poloze.
Základní
V obecných mikroskopech se ohnisková rovina čočky objektivu shoduje s detektorem, takže pozorovaná rovina obrazu je izolována od sousední axiální roviny, zatímco u konfokálních mikroskopů je vzorek osvětlen použitím světelné skvrny s omezenou difrakcí a v Tohoto izolačního efektu je dosaženo použitím dírky v dráze sběrného světla v ohnisku bodového konjugátu pro filtrování rozptýleného světla pro zlepšení rozlišení.
Funkce zobrazování
Malým otvorem v dráze sběrného světla může procházet pouze světlo odražené zpět od vrstvy konjugovaného vzorku a zbývající irelevantní odrazy vrstvy vzorku jsou blokovány malým otvorem. To může mít za následek výrazné zvýšení rozlišení. Níže je ukázáno vedle sebe srovnání vícerozměrné fluorescenční mikroskopie a konfokální mikroskopie stejného tlustého vzorku. Když je pořízena série snímků v různých ohniskových rovinách, může být generováno to, co se běžně nazývá "z-stack", a tento obrázek ukazuje jak rozlišení, tak kontrastní zisky, které nabízí konfokální mikroskopie, a základní příčiny těchto zisků. Zkoumání obrazu v horní části zásobníku se zobrazovací rovinou nad tkání odhaluje ve fluorescenčním obrazu mnoho rozptýleného světla, zatímco konfokální obraz se jeví jako černý. Toto snížení PSF v axiálním směru je přímo zodpovědné za rozdíl v rozlišení pozorovaný na optickém rozhraní uprostřed z-souboru.
Další vlastností laserové skenovací konfokální mikroskopie je to, že se jedná o technologii skenovacího zobrazování. Tradiční technologie širokoúhlého osvětlení osvětluje celý vzorek, takže obraz lze přímo zachytit pouhým okem nebo detektorem, ale LSCM používá paprsek nebo více zaostřených paprsků procházejících vzorkem pro skenování a zobrazování a výsledný obraz je nazývaná optická sekce. Následující obrázek ukazuje rozdíl mezi tradiční metodou širokoúhlého osvětlení a metodou laserového skenování konfokálního osvětlení.
Proto je na obrázku níže uvedena praktická pracovní metoda moderního konfokálního mikroskopu. Excitační světlo emitované laserem prochází dichroickým zrcadlem a snímá ve směru x a y vzorku přes dvojici vibrujících zrcadel. Excitace (nebo odraz) vzorku Světlo vstupuje do detektoru PMT dírkou a je zaznamenáno a zaznamenaný skenovaný obraz je rekonstruován počítačem, aby se získal skutečný obraz vzorku.
