Vylepšení výhod multifotonové laserové skenovací mikroskopie
Laserová skenovací multifotonová mikroskopie je významným vylepšením oproti optické mikroskopii. Může pozorovat hlubokou strukturu živých buněk, fixovaných buněk a tkání a může získat jasné a ostré vícevrstvé struktury v rovině Z, tedy optické řezy, ze kterých může sestavit trojrozměrnou pevnou strukturu vzorku. Konfokální mikroskopie využívá zdroj laserového světla, který po expanzi vyplní celou zadní ohniskovou rovinu čočky objektivu a poté prochází čočkovým systémem čočky objektivu, aby se sblížil do velmi malého bodu v ohniskové rovině preparátu. V závislosti na numerické apertuře čočky objektivu je průměr nejjasnějšího osvětlovacího bodu přibližně 0,25 ~ 0,8 μm a hloubka je přibližně 0,5 ~ 1,5 μm . Velikost konfokální skvrny závisí na konstrukci mikroskopu, vlnové délce laseru, vlastnostech čočky objektivu, nastavení stavu skenovací jednotky a vlastnostech vzorku. Rozsah osvětlení a hloubka osvětlení polního mikroskopu jsou velké, zatímco osvětlení konfokálního mikroskopu je soustředěno na přesné zaostření na ohniskovou rovinu. Nejzákladnější výhodou konfokální mikroskopie je, že může provádět jemné optické řezy silných fluorescenčních vzorků (které mohou dosáhnout 50 μm nebo více) a tloušťka řezů je asi 0,5 až 1,5 μm. Sériové snímky optických řezů lze získat pohybem vzorku nahoru a dolů pomocí sofistikovaného krokového motoru v ose Z mikroskopu. Sběr obrazových informací je řízen v přesné rovině, aniž by byl rušen signály vysílanými z jiných míst na vzorku. Po odstranění vlivu fluorescence pozadí a zvýšení poměru signálu k šumu se kontrast a rozlišení konfokálních snímků výrazně zlepší ve srovnání s tradičními fluorescenčními snímky s osvětlením pole. V mnoha exemplářích je mnoho složitých konstrukčních komponent propleteno a tvoří složité systémy, ale jakmile se podaří shromáždit dostatek optických řezů, můžeme je pomocí softwaru rekonstruovat ve třech rozměrech. Tato experimentální metoda byla široce používána v biologickém výzkumu k objasnění složitých strukturních a funkčních vztahů mezi buňkami nebo tkáněmi.
