Rozdíl mezi fluorescenčním mikroskopem a normálním mikroskopem
1. Podívejte se na způsob osvětlení
Osvětlovací metoda fluorescenčního mikroskopu je obecně epi-typu, to znamená, že zdroj světla je umístěn na testovaný vzorek přes čočku objektivu.
2. Podívejte se na rozlišení
Fluorescenční mikroskopy používají jako zdroj světla ultrafialové světlo s relativně krátkou vlnovou délkou, ale rozlišení je vyšší než u běžných optických mikroskopů.
3, rozdíl ve filtru
Fluorescenční mikroskop používá dva speciální filtry, používané před světelným zdrojem k odfiltrování viditelného světla a používané mezi čočkou objektivu a okulárem k odfiltrování ultrafialového světla, které může chránit lidské oči.
Fluorescenční mikroskop je také typem optického mikroskopu, hlavně proto, že vlnová délka excitovaná fluorescenčním mikroskopem je krátká, takže to vede k rozdílu ve struktuře a použití fluorescenčního mikroskopu a běžného mikroskopu. Většina fluorescenčních mikroskopů má dobrou funkci pro zachycení slabého světla. , takže při extrémně slabé fluorescenci je jeho zobrazovací schopnost také dobrá. Ve spojení s neustálým zlepšováním fluorescenční mikroskopie v posledních letech se také výrazně snížil šum. Proto se stále více používají fluorescenční mikroskopy.
Znalost dvoufotonové fluorescenční mikroskopie
Základní princip dvoufotonové excitace je: v případě vysoké hustoty fotonů mohou fluorescenční molekuly absorbovat dva dlouhovlnné fotony současně a po velmi krátké době života tzv. excitovaného stavu emitovat krátkovlnný foton. ; účinek je stejný jako při použití fotonu s vlnovou délkou poloviční oproti dlouhé vlnové délce k excitaci fluorescenční molekuly. Dvoufotonová excitace vyžaduje vysokou hustotu fotonů, a aby nedošlo k poškození buněk, používá dvoufotonová mikroskopie vysokoenergetické pulzní lasery s uzamčeným módem. Tento laser vyzařuje laserové světlo s vysokou špičkovou energií a nízkou průměrnou energií, s šířkou pulzu pouze 100 femtosekund a frekvencí 80 až 100 MHz. Když se k zaostření fotonů pulzního laseru použije čočka objektivu s vysokou numerickou aperturou, hustota fotonů v ohnisku čočky objektivu je nejvyšší a k buzení dvěma fotony dochází pouze v ohnisku čočky objektivu, takže dvoufotonový mikroskop nepotřebuje konfokální dírku, což zlepšuje účinnost fluorescenční detekce.
Při obecném fluorescenčním jevu může fluorescenční molekula v důsledku nízké hustoty fotonů excitačního světla absorbovat pouze jeden foton ve stejnou dobu a poté emitovat fluorescenční foton prostřednictvím radiačního přechodu, který se nazývá jednofotonová fluorescence. Pro fluorescenční excitační proces s laserem jako zdrojem světla může nastat dvoufotonový nebo dokonce vícefotonový fluorescenční fenomén. V této době je intenzita použitého zdroje excitačního světla vysoká a hustota fotonů splňuje požadavek, aby fluorescenční molekula pohltila dva fotony současně. V procesu použití obecného laseru jako zdroje excitačního světla hustota fotonů stále nestačí k produkci dvoufotonové absorpce. Obvykle se používá femtosekundový pulzní laser a jeho okamžitý výkon může dosahovat řádu megawattů. Proto je vlnová délka dvoufotonové fluorescence kratší než vlnová délka excitačního světla, což je ekvivalentní efektu vyvolanému excitací poloviční excitační vlnovou délkou.
Dvoufotonová fluorescenční mikroskopie má mnoho výhod:
1) Dlouhovlnné světlo je méně ovlivněno rozptylem než světlo krátkovlnné a může snadno proniknout do vzorku;
2) Fluorescenční molekuly mimo ohniskovou rovinu nejsou excitovány, takže více excitačního světla může dosáhnout ohniskové roviny, takže excitační světlo může proniknout hlouběji do vzorků;
3) Dlouhovlnné blízké infračervené světlo je pro buňky méně toxické než světlo krátkovlnné;
4) Při prohlížení vzorků pomocí dvoufotonové mikroskopie je fotobělení a fototoxicita přítomna pouze v ohniskové rovině. Dvoufotonová mikroskopie je proto vhodnější pro pozorování silných vzorků než jednofotonová mikroskopie, pro pozorování živých buněk nebo pro provádění experimentů fotobělení s pevným bodem.
Znalost konfokální fluorescenční mikroskopie
Základní princip konfokální fluorescenční mikroskopie: pomocí bodového zdroje světla k osvětlení preparátu se na ohniskové rovině vytvoří malá světelná skvrna s dobře definovaným obrysem. tvořený děličem paprsků. Dělič paprsku posílá fluorescenci přímo do detektoru. Před zdrojem světla a detektorem je dírka, která se nazývá dírka osvětlení a dírka detekce. Geometrické rozměry obou jsou stejné, přibližně 100-200 nm; vzhledem ke světelné skvrně na ohniskové rovině jsou tyto dvě konjugované, to znamená, že světelná skvrna prochází řadou čoček a nakonec může být zaostřena na osvětlovací dírku a detekční dírku současně. Tímto způsobem lze světlo z ohniskové roviny koncentrovat v dosahu detekčního otvoru, zatímco rozptýlené světlo nad nebo pod ohniskovou rovinou je blokováno z detekčního otvoru a nelze jej zobrazit. Vzorek je bod po bodu snímán laserem a trubice fotonásobiče po detekci dírky také získá konfokální obraz odpovídajícího světelného bodu bod po bodu, který je převeden na digitální signál a přenesen do počítače a nakonec agregován na obrazovky do jasného konfokálního obrazu celé ohniskové roviny. .
Každý snímek ohniskové roviny je ve skutečnosti optickým řezem preparátem a tento optický řez má vždy určitou tloušťku, známou také jako optický řez. Protože intenzita světla v ohnisku je mnohem větší než v neohniskovém bodě a světlo v neohniskové rovině je odfiltrováno dírkou, je hloubka pole konfokálního systému přibližně nulová a skenování podél Osa Z může realizovat optickou tomografii, která tvoří dvourozměrný optický řez v zaostřeném místě vzorku. Kombinací skenování v rovině XY (ohnisková rovina) se skenováním v ose Z (optická osa), akumulací dvourozměrných obrazů po sobě jdoucích vrstev a zpracováním speciálním počítačovým softwarem, lze získat trojrozměrný obraz vzorku.
To znamená, že detekční dírka a dírka světelného zdroje jsou vždy zaostřeny na stejný bod, takže fluorescence excitovaná vně ostřící roviny nemůže vstoupit do detekční dírky.
Jednoduchým vyjádřením principu činnosti konfokálního laseru je, že jako zdroj světla používá laser a na základě tradičního zobrazování pomocí fluorescenčního mikroskopu je připojeno laserové skenovací zařízení a konjugované zaostřovací zařízení a digitální získávání a zpracování obrazu. systém je řízen počítačem.
