Návrh nízkonákladových fluorescenčních mikroskopů a mikroskopů s jasným polem
Krok 1: Přehled fluorescenční mikroskopie
Abyste pochopili základní pojmy fluorescenční mikroskopie, představte si hustý les v noci se stromy, zvířaty, keři a dalšími lesy, které v něm žijí. Posvítíte-li baterkou do lesa, uvidíte všechny tyto struktury a je těžké si představit konkrétní živočichy nebo rostliny. Za předpokladu, že máte zájem vidět v lese pouze keře borůvek. Abyste toho dosáhli, je třeba vycvičit světlušky, aby je přitahovaly pouze keře borůvek, aby se při pohledu do lesa rozsvítily pouze keře borůvek. Dá se říci, že pomocí světlušek označujete keře borůvek, abyste viděli strukturu borůvek v lese.
V této analogii představují lesy celý vzorek, keře borůvek představují struktury, které chcete zobrazit (jako jsou specifické buňky nebo subcelulární organely), a světlušky jsou fluorescenční sloučeniny. Situace při samotném osvětlení svítilny střelce bez světlušek je podobná mikroskopu ve světlém poli.
Dalším krokem je pochopení základních funkcí fluorescenčních sloučenin (také známých jako fluorofory). Fluorescenční shluky jsou ve skutečnosti malé objekty (v nanoměřítku) navržené tak, aby spojovaly specifické struktury ve vzorku. Absorbují světlo úzkého rozsahu vlnových délek a znovu vyzařují světlo jiné vlnové délky. Například fluorofor může absorbovat modré světlo (tj. fluorofor je excitován modrým světlem) a poté znovu emitovat zelené světlo. Obvykle se to shrnuje excitačním a emisním spektrem (jak je znázorněno na obrázku výše). Tyto grafy zobrazují vlnové délky světla absorbovaného fluorofory a vlnové délky světla emitovaného fluorofory.
Konstrukce mikroskopu je velmi podobná běžnému mikroskopu ve světlém poli, se dvěma hlavními rozdíly. Za prvé, světlo osvětlující vzorek musí mít vlnovou délku, která excituje fluorescenční skupinu (pro příklad výše je světlo modré). Za druhé, mikroskop potřebuje pouze sbírat emitované světlo (zelené světlo) a blokovat modré světlo. Je to proto, že modré světlo je všude, ale zelené světlo pochází pouze ze specifických struktur ve vzorku. K blokování modrého světla mají mikroskopy obvykle něco, čemu se říká dlouhý propustný filtr, který umožňuje průchod zeleného světla bez modrého světla. Každý dolní propust má mezní vlnovou délku. Pokud je vlnová délka světla větší než mezní vlnová délka, může procházet filtrem. Proto je název 'Long Distance Pass'. Kratší vlnové délky jsou blokovány.
Krok 2: Použijte optický modelovací mikroskop
Toto je další krok při navrhování mikroskopů založených na základních principech. Není potřeba stavět fluorescenční mikroskop, takže pokud se nechcete do optiky ponořit hlouběji, můžete to přeskočit.
Mikroskopy ve světlém poli i fluorescenční mikroskopy lze modelovat pomocí zařízení paprskové optiky. Základním předpokladem paprskové optiky je, že chování světla je podobné jako u světla šířícího se od zdroje světla. Když se rozhlédnete po místnosti, uvidíte sluneční světlo za oknem nebo světlo, které přináší žárovka. Poté je světlo absorbováno nebo odráženo předměty v místnosti. Některé odražené světlo jej nasměruje k vašim očím. Pokud je objekt osvětlen, můžete si představit, že každý bod na objektu vyzařuje světlo ve všech směrech (jak je znázorněno na obrázku výše). Čočka, stejně jako čočka v našich očích, zaměřuje světlo na bod, takže můžeme vidět předměty. Bez čočky se světlo dále šíří ven a nevytváří obraz.
