Srovnání mezi konfokálním mikroskopem a běžným optickým mikroskopem
Obecný optický mikroskop
Obecný biologický mikroskop se skládá ze tří částí, a to: ① osvětlovací systém, včetně světelného zdroje a kondenzoru; ② Optický zesilovací systém, který se skládá z objektivu a okuláru, je hlavním tělem mikroskopu. Aby se eliminovala sférická a chromatická aberace, jsou jak okulár, tak čočka objektivu složeny z komplexních skupin čoček; (3) mechanické zařízení, používané pro upevnění materiálů a pohodlné pozorování.
Zda je obraz mikroskopu čistý nebo ne, závisí nejen na zvětšení, ale také na rozlišení mikroskopu. Rozlišení označuje schopnost mikroskopu (nebo místa, kde jsou lidské oči vzdáleny 25 cm od cíle) rozlišit malý interval objektu zui. Rozlišení závisí na vlnové délce světla, aperturním poměru a indexu lomu prostředí, což je vyjádřeno vzorcem:
R=0.61λ /N．A． N．A．＝ｎsin /2
Kde: n= index lomu média;=zrcadlový úhel (úhel otevření preparátu vůči cloně objektivu) a NA= numerická apertura. Úhel zrcadla je vždy menší než 180? Proto musí být hodnota zui sina/2 menší než 1.
Index lomu skla použitého pro výrobu optických čoček je 1,65~1,78 a index lomu použitého média je blíže indexu lomu skla, tím lépe. Pro suchou čočku objektivu je médiem vzduch a poměr clony je obecně 0.05 ~ 0,95; Olejová čočka používá jako médium vonný asfalt a rychlost otevření čočky se může blížit 1,5.
Vlnová délka běžného světla je 400~700nm, takže rozlišení mikroskopu není menší než 0,2μm a rozlišení lidského oka je 0,2mm, takže velké zvětšení zui navržené firmou obecný mikroskop je obvykle 1000X x.
Proč potřebujete konfokální mikroskop?
1. Optický mikroskop byl zdokonalen díky úsilí a vylepšení našich velkých předchůdců. Ve skutečnosti nám obyčejné mikroskopy mohou poskytnout krásné mikroskopické snímky jednoduše a rychle. Stala se však událost, která přinesla do tohoto téměř dokonalého mikroskopického světa revoluční inovaci, a to vynález „laserového skenovacího konfokálního mikroskopu“. Tento nový mikroskop se vyznačuje tím, že využívá optický systém, který pouze extrahuje obrazovou informaci v rovině, kde je soustředěno ohnisko, a obnovuje získané informace v obrazové paměti při změně ohniska, takže živý obraz s kompletní trojrozměrnou informací lze získat. Touto metodou lze jednoduše získat informace o tvaru povrchu, které nelze potvrdit běžnými mikroskopy. Navíc pro běžné optické mikroskopy jsou „zlepšení rozlišení“ a „prohloubení hloubky ostrosti“ rozporuplné podmínky, zvláště při velkém zvětšení, ale u konfokálních mikroskopů je tento problém vyřešen.
2. Výhody konfokálního optického systému
Konfokální optický systém osvětluje bod vzorku a odražené světlo je také přijímáno bodovými receptory. Když je vzorek umístěn do polohy zaostření, téměř všechno odražené světlo může dosáhnout fotoreceptoru, ale když se vzorek odchýlí od ohniska, odražené světlo nemůže dosáhnout fotoreceptoru. To znamená, že v konfokálním optickém systému bude na výstupu pouze obraz, který se shoduje s ohniskem, a bude stíněna facula a zbytečné rozptýlené světlo.
3. Proč používat laser?
V konfokálním optickém systému je vzorek osvětlen a odražené světlo je rovněž přijímáno bodovým fotoreceptorem. Bodový zdroj světla se proto stává nezbytným. Laser patří k velmi bodovým světelným zdrojům. Ve většině případů světelný zdroj konfokálního mikroskopu využívá laserový světelný zdroj. Charakteristiky laseru, jako je monochromatičnost, směrovost a vynikající tvar paprsku, jsou také důležitými důvody pro jeho široké použití.
4. Je možné pozorování v reálném čase založené na vysokorychlostním skenování.
Při laserovém skenování je použit akustický optický deflektor (AO prime element) v horizontálním směru a Servo Galvano-mirror ve vertikálním směru. Protože v akustické optické vychylovací jednotce není žádná mechanická vibrační část, může skenovat vysokou rychlostí a je možné pozorovat v reálném čase na monitorovací obrazovce. Vysoká rychlost této kamery je velmi důležitým projektem, který přímo ovlivňuje rychlost ostření a načítání polohy.
5. Vztah mezi polohou zaostření a jasem
V konfokálním optickém systému je při správném umístění vzorku do ohniskové polohy jas velký a před ním i za ním jeho jas prudce klesne (plná čára na obrázku 4). Tato citlivá selektivita ohniskové roviny je také principem měření výškového směru konfokálního mikroskopu a rozšíření ohniskové hloubky. Naproti tomu běžný optický mikroskop nemá zjevnou změnu jasu před a po poloze zaostření (tečkovaná čára na obrázku 4).
6. Vysoký kontrast a vysoké rozlišení
V obecném optickém mikroskopu bude odražené světlo odchylující se od ohniska rušit a bude se překrývat s ohniskovou zobrazovací částí, čímž se sníží kontrast obrazu. Naproti tomu v konfokálním optickém systému je rozptýlené světlo mimo ohnisko a rozptýlené světlo uvnitř čočky objektivu téměř úplně odstraněno, takže lze získat obraz s velmi vysokým kontrastem. Navíc, protože světlo prochází čočkou objektivu dvakrát, bodový obraz se nejprve zaostří a zlepší se i rozlišení mikroskopu.
7. Funkce optické lokalizace
V konfokálním optickém systému je odražené světlo jiné části než ohniska stíněno mikropóry. Proto se při pozorování trojrozměrného vzorku vytvoří obraz podobný tomu, který vznikne po rozříznutí vzorku s ohniskem (obrázek 5). Tento efekt se nazývá optická lokalizace, která patří k jedné ze specialit konfokálního optického systému.
8. Funkce zaměření pohyblivé paměti
Takzvané odražené světlo mimo ohnisko je stíněno mikropóry. Na druhou stranu lze mít za to, že všechny body na snímku tvořeném konfokálním optickým systémem se shodují s ohniskem. Pokud se tedy trojrozměrný vzorek posune ve směru osy Z (optické osy), obraz se shromáždí a uloží do paměti a zui nakonec získá obraz vytvořený shodou celého vzorku a ohniska. . Tímto způsobem se funkce nekonečné hloubky ostrosti nazývá funkce mobilní paměti.
9. Funkce měření tvaru povrchu
Ve funkci fokusního pohybu lze tvar povrchu vzorku měřit bezkontaktním způsobem přidáním smyčky pro záznam výšky. Na základě této funkce je možné zaznamenat souřadnice osy Z tvořené velkou hodnotou jasu zui v každém pixelu a na základě této informace lze získat informace týkající se tvaru povrchu vzorku.
10. Vysoce přesné funkce měření mikrovelikosti
Jednotka pro příjem světla využívá jednorozměrný zobrazovací snímač CCD, takže nemůže být ovlivněna sklonem skenování skenovacího zařízení, takže lze dokončit vysoce přesné měření. Kromě toho, protože je současně přijata funkce paměti pohybu zaostření s nastavitelnou hloubkou zaostření, lze eliminovat chybu měření způsobenou posunutím zaostření.
11. Analýza trojrozměrného obrazu
Pomocí funkce měření tvaru povrchu lze snadno vytvořit trojrozměrný obraz povrchu vzorku. Nejen to, ale také lze provádět mnoho druhů analýz, jako je: měření drsnosti povrchu, plocha, objem, plocha povrchu, kruhovitost, poloměr, délka zui, obvod, těžiště, tomografický snímek, FFT transformace, čára měření šířky a tak dále.
Laserový konfokální rastrovací mikroskop lze použít nejen k pozorování morfologie buněk, ale také ke kvantitativní analýze biochemických složek v buňkách, statistikám optické hustoty a měření morfologie buněk.
