Srovnání a vlastnosti fluorescenčních mikroskopů a konvenčních optických mikroskopů
Fluorescenční mikroskop se liší od běžného optického mikroskopu. Namísto pozorování vzorků pod osvětlením z konvenčního světelného zdroje používá světlo specifické vlnové délky (obvykle ultrafialové nebo modrofialové světlo) k excitaci fluorescenčních látek ve vzorku, což způsobuje, že emitují fluorescenci. Světelný zdroj fluorescenčního mikroskopu tedy neslouží k přímému osvětlení; působí jako zdroj energie pro excitaci endogenních fluorescenčních látek ve vzorku. Vzorek jsme schopni pozorovat ne díky osvětlení ze zdroje, ale díky fluorescenci emitované fluorescenčními látkami ve vzorku po absorpci excitačního světla.
Z toho vyplývá, že klíčovou vlastností fluorescenčního mikroskopu je jeho světelný zdroj, který může dodávat hojné excitační světlo ve specifickém rozsahu vlnových délek, aby poskytl dostatečnou intenzitu excitace pro fluorescenční látky v testovaném vzorku. Mezitím musí být fluorescenční mikroskop vybaven odpovídajícím filtračním systémem. Jako základní nástroj pro fluorescenční histochemii sestává především z ultravysokotlakého světelného zdroje, sady filtrů (včetně excitačních filtrů a bariérových filtrů), optického systému a fotografického systému. Funguje tak, že excituje vzorky světlem o určité vlnové délce za vzniku fluorescence.
Fluorescenční excitační metody: Klasifikovány podle rozsahu vlnových délek na UV excitaci (metoda ultrafialového osvětlení) a BV excitaci (metoda modrofialového světla). UV excitace využívá k excitaci blízké ultrafialové světlo kratší než 400 nm. Není zapojeno žádné viditelné excitační světlo, takže pozorovaná fluorescence ukazuje vlastní fluorescenci barviva. To usnadňuje rozlišení specifické fluorescence na vzorku od autofluorescence tkáně pozadí.
BV excitační metoda: Excitace se provádí světlem v rozsahu od ultrafialového po modré světlo se středem při 404 nm a 434 nm. Protože při této metodě vzorek ozařuje modré světlo, musí cut-off filtr fluorescenčního pozorovacího systému zcela blokovat modré světlo a přitom plně propouštět požadovanou zelenou a žlutou fluorescenci. Tato metoda je aplikována na fluorochromy používané ve fluorescenčních protilátkových technikách. Maximální absorpční vlnová délka excitačního světla a maximální emisní vlnová délka fluorescence jsou relativně blízko, takže pro BV excitaci jsou nutné filtry s ostrým řezem. Jako excitační světlo je zde použito modré světlo, které přináší vysokou absorpční účinnost fluorochromů a přináší jasnější snímky. Jeho nevýhodou je, že fluorescenci pod 500 nm nelze detekovat a signály nad 500 nm dávají celému obrazu žlutý nádech. Ve fluorescenčních protilátkových testech se specifita většinou posuzuje podle charakteristické barvy fluorochromu. Při hodnocení jemné specifičnosti tedy může mít výše uvedená nevýhoda BV excitační metody významný dopad.
