Klasifikace a funkce mikroskopů pro buněčný výzkum
Mikroskop je primární nástroj pro pozorování buněk. Podle různých světelných zdrojů jej lze rozdělit do dvou kategorií: optické mikroskopy a elektronové mikroskopy. První používá jako zdroj světla viditelné světlo (UV mikroskopy používají ultrafialové světlo), zatímco druhý používá jako zdroj světla elektronové paprsky.
-,Optický mikroskop
(1) Běžný optický mikroskop
Běžné biologické mikroskopy se skládají ze tří částí, a to: ① osvětlovací systém včetně světelného zdroje a kondenzoru; ② optický zvětšovací systém, složený z objektivu a okuláru, který je hlavním tělem mikroskopu. Aby se eliminovala sférická a chromatická aberace, okulár i objektiv ③Mechanické zařízení, používané k fixaci materiálu a usnadnění pozorování (obrázek 2-1).
O tom, zda je obraz mikroskopu čistý, nerozhoduje pouze zvětšení, ale souvisí také s rozlišovací schopností mikroskopu. Rozlišení se týká schopnosti mikroskopu (nebo lidského oka být 25 cm od cíle) rozlišit nejmenší vzdálenost mezi objekty. Velikost rozlišení je určena poměrem vlnové délky a apertury světla a indexem lomu média jsou vyjádřeny vzorcem:
Ve vzorci: n=index lomu média;=aperturní úhel (úhel otevření preparátu k apertuře objektivu), NA=apertura objektivu (numerická apertura). Úhel čočky je vždy menší než 180 stupňů, takže maximální hodnota sina/2 musí být menší než 1.
Index lomu skla použitého k výrobě optické čočky je 1,65 až 1,78 a index lomu použitého média je blíže sklu, tím lépe. U suchých objektivů je médiem vzduch a poměr clony objektivu je obecně 0.05 až 0,95; u olejových objektivů se jako médium používá cedrový olej a poměr světelnosti objektivu se může blížit 1,5.
Vlnová délka běžného světla je {{0}}nm, takže hodnota rozlišení mikroskopu nebude menší než 0,2μm a rozlišení lidského oka je 0,2 mm, takže maximální zvětšení obecné konstrukce mikroskopu je obvykle 1000X.
(2) Fluorescenční mikroskopie
Některé látky v buňkách, jako je chlorofyl, mohou po ozáření ultrafialovými paprsky fluoreskovat; některé látky samy fluoreskovat neumí, ale pokud jsou obarveny fluorescenčními barvivy nebo fluorescenčními protilátkami, mohou fluoreskovat i při ozáření ultrafialovými paprsky a fluorescenční mikroskop (obr. 2-2, 3, 4) je jedním z nástrojů pro kvalitativní a kvantitativní výzkum takových látek.
Fluorescenční mikroskopy a běžné mikroskopy mají následující rozdíly:
1. Metoda osvětlení je obvykle epiiluminace, to znamená, že zdroj světla je promítán na vzorek přes čočku objektivu (obrázek 2-3);
2. Světelným zdrojem je ultrafialové světlo, vlnová délka je kratší a rozlišení je vyšší než u běžných mikroskopů;
3. Existují dva speciální filtry, jeden před světelným zdrojem se používá k odfiltrování viditelného světla a jeden mezi okulárem a čočkou objektivu se používá k odfiltrování ultrafialového světla k ochraně očí.
(3) Laserový skenovací konfokální mikroskop
Laserový konfokální skenovací mikroskop (laserový konfokální skenovací mikroskop, obrázek 2-5, 6) používá laser jako zdroj skenovacího světla a skenuje zobrazení bod po bodu, řádek po řádku, povrch po povrchu a skenovací laser a kolekce fluorescence sdílejí čočka objektivu a ohnisko čočky objektivu je Ohniskový bod skenovacího laseru je také objektovým bodem okamžitého zobrazování. Protože vlnová délka laserového paprsku je krátká a paprsek je velmi tenký, má konfokální laserový rastrovací mikroskop vyšší rozlišení, které je asi 3x větší než u běžného optického mikroskopu. Systém je zaostřen jednou a skenování je omezeno na jednu rovinu vzorku. Když je hloubka zaostření různá, lze získat snímky různých úrovní hloubky vzorku. Tyto obrazové informace jsou uloženy v počítači. Pomocí počítačové analýzy a simulace lze zobrazit trojrozměrnou strukturu buněčného vzorku.
Konfokální laserovou skenovací mikroskopii lze použít nejen pro pozorování morfologie buněk, ale také pro kvantitativní analýzu intracelulárních biochemických složek, statistiku optické hustoty a měření morfologie buněk.
(4) Mikroskop v tmavém poli
Mikroskop s tmavým polem (mikroskop s tmavým polem, obrázek 2-7) má uprostřed kondenzoru světlý list, takže osvětlovací světlo neproniká přímo do lidské čočky a pouze světlo odražené a ohýbané vzorkem. je povoleno vstoupit do čočky objektivu, takže pozadí zorného pole je černé, okraje objektů jsou světlé. Pomocí tohoto mikroskopu lze vidět částice o velikosti až 4-200nm a rozlišení může být 50krát vyšší než u běžných mikroskopů.
(5) Mikroskop s fázovým kontrastem
Phasecontrast microscope (phasecontrast microscope, Figure 2-8, 9) P. Zernike byl vynalezen v roce 1932 a získal za něj v roce 1953 Nobelovu cenu za fyziku. Největší vlastností tohoto mikroskopu je, že dokáže pozorovat neobarvené vzorky a živé buňky.
Základním principem mikroskopie s fázovým kontrastem je změnit rozdíl optické dráhy viditelného světla procházejícího vzorkem na rozdíl amplitud, čímž se zlepší kontrast mezi různými strukturami a různé struktury budou jasně viditelné. Po průchodu preparátem se světlo láme, odchyluje od původní optické dráhy a zpožďuje se o 1/4λ (vlnová délka). Zesílit, zvýšit nebo snížit amplitudu, zvýšit kontrast. Z hlediska struktury mají mikroskopy s fázovým kontrastem dvě speciální vlastnosti, které se liší od běžných optických mikroskopů:
1. Prstencová clona je umístěna mezi světelným zdrojem a kondenzorem a její funkcí je přimět světlo procházející kondenzorem vytvořit dutý světelný kužel a zaostřit na preparát.
2. Fázová destička (prstencová fázová destička) přidává fázovou destičku potaženou fluoridem hořečnatým v čočce objektivu, která může zpozdit fázi přímého světla nebo ohybového světla o 1/4λ. Existují dva typy:
①A plus fázová deska: Přímé světlo je zpožděno o 1/4λ. Po spojení dvou skupin světelných vln se světelné vlny sečtou a amplituda se zvýší. Struktura vzorku je jasnější než okolní médium a vytváří jasný kontrast (nebo negativní kontrast).
② B plus fázová deska: Difraktované světlo je zpožděno o 1/4λ. Po zkombinování dvou sad paprsků jsou světelné vlny odečteny a amplituda se zmenší, čímž se vytvoří tmavý kontrast (nebo pozitivní kontrast) a struktura je tmavší než okolní médium.
