Výhody vylepšení laserových skenovacích multifotonových mikroskopů
Laserový rastrovací multifotonový mikroskop je významným vylepšením optické mikroskopie, projevující se především schopností pozorovat hluboké struktury živých buněk, fixovaných buněk a tkání a získat jasné a ostré více{0}}vrstvé Z{1}}rovinné struktury, konkrétně optické řezy, které lze použít ke konstrukci trojrozměrných pevných struktur vzorků. Konfokální mikroskop využívá zdroj laserového světla, který je rozšířen tak, aby vyplnil celou ohniskovou rovinu čočky objektivu, a poté se sbíhá do velmi malých bodů v ohniskové rovině preparátu prostřednictvím čočkového systému čočky objektivu. Podle numerické apertury čočky objektivu je průměr jasného osvětlovacího bodu asi 0,25-0,8 μm a hloubka asi 0,5-1,5 μm. Velikost konfokálního bodu je určena konstrukcí mikroskopu, vlnovou délkou laseru, charakteristikami objektivu, nastavením stavu skenovací jednotky a vlastnostmi vzorku. Rozsah osvětlení a hloubka pole mikroskopu jsou velké, zatímco osvětlení konfokálního mikroskopu je zaostřeno na ohnisko v ohniskové rovině. Základní výhodou konfokální mikroskopie je, že může provádět jemné optické řezy na silných fluorescenčních vzorcích (až 50 μm nebo více), o tloušťce přibližně 0,5 až 1,5 μm. Sérii obrazů optických řezů lze získat pohybem preparátu nahoru a dolů pomocí krokového motoru mikroskopu v ose Z-. Shromažďování obrazových informací je řízeno v rovině * * bez rušení signálů vyzařovaných z jiných pozic na vzorku. Po odstranění vlivu fluorescence pozadí a zvýšení poměru signálu k šumu se kontrast a rozlišení konfokálních obrazů výrazně zlepšily ve srovnání s tradičními fluorescenčními obrazy osvětlení pole. V mnoha vzorcích se složité konstrukční komponenty prolínají a vytvářejí složité systémy, ale jakmile se podaří nashromáždit dostatek optických řezů, můžeme použít software k jejich rekonstrukci ve třech rozměrech. Tato experimentální metoda byla široce používána v biologickém výzkumu k objasnění složitých strukturních a funkčních vztahů mezi buňkami nebo tkáněmi.
