Srovnání různých technik pro mikroskopii s vysokým rozlišením
Pro konvenční světelnou mikroskopii omezuje difrakce světla rozlišení zobrazení na přibližně 250 nm. Dnes to mohou techniky s vysokým rozlišením zlepšit více než desetkrát. Této techniky je dosaženo především třemi metodami: jednomolekulární lokalizační mikroskopií, včetně fotosenzitivní lokalizační mikroskopie (PALM) a stochastickou optickou rekonstrukční mikroskopií (STORM); mikroskopie strukturovaného osvětlení (SIM); a mikroskopie se stimulovanou emisní deplecí (STED). Jak si vybrat technologii s vysokým rozlišením, to je to, co každého zajímá. "Bohužel neexistují žádné jednoduché principy pro rozhodování, kterou metodu použít," říká Mathew Stracy, postdoktorandský výzkumník na University of Oxford ve Velké Británii. "Každý má své výhody a nevýhody." Vědci samozřejmě také řeší, jak vybrat správnou metodu pro konkrétní projekt. "V kontextu biozobrazování patří mezi klíčové faktory, které je třeba vzít v úvahu: prostorové a časové rozlišení, citlivost na fotopoškození, kapacita značení, tloušťka vzorku a fluorescence pozadí nebo buněčná autologní fluorescence." Jak to funguje Různé mikroskopy s vysokým rozlišením pracují různými způsoby. V případě PALM a STORM je v daném okamžiku excitována nebo fotoaktivována pouze malá část fluorescenčních markerů, což umožňuje jejich nezávislou lokalizaci s vysokou přesností. Procházení tímto procesem se všemi fluorescenčními značkami vede k úplnému obrazu v super rozlišení. Stefan Hell, jeden z laureátů Nobelovy ceny za chemii za rok 2014 a ředitel Institutu Maxe Plancka pro biofyzikální chemii, řekl: „Systém PALM/STORM je relativně snadno nastavitelný, ale je obtížné jej aplikovat, protože fluorescenční Skupina musí mít schopnost fotoaktivace. Omezení Nevýhodou je, že potřebují detekovat jednu fluorescenční molekulu v kontextu buňky a jsou méně spolehlivé než STED." STED používá laserový puls k excitaci fluoroforu a prstencový laser k zhášení fluoroforu, přičemž pro super rozlišení zůstává pouze střední fluorescence o velikosti nanometrů. Naskenováním celého vzorku vznikne obrázek. "Výhodou STEDu je, že jde o tlačítkovou technologii," vysvětlil Hell. "Funguje jako standardní konfokální fluorescenční mikroskop." Může také zobrazovat živé buňky pomocí fluoroforů, jako jsou zelené nebo žluté fluorescenční proteiny a barviva odvozená od rhodaminu. Parametrické srovnání I když všechny super-rozlišovací techniky překonávají konvenční světelnou mikroskopii z hlediska rozlišení, navzájem se liší. SIM karta zhruba zdvojnásobuje rozlišení na přibližně 100 nm. PALM a STORM mohou rozlišit 15 nm cíle. Podle Hella poskytuje STED prostorové rozlišení 30 nm v živých buňkách a 15 nm v pevných buňkách. Pokud jde o konkrétní aplikace, musíme zvážit i odstup signálu od šumu. V některých případech může nižší rozlišení, ale vyšší SNR vést k lepšímu obrazu než naopak (vyšší rozlišení, ale nižší SNR). Velmi důležitá je také rychlost pořízení obrazu, zejména u živých buněk. "Všechny techniky s vysokým rozlišením jsou pomalejší než konvenční techniky fluorescenčního zobrazování," řekl Stracy. "PALM/STORM je nejpomalejší, k získání jednoho obrázku potřebuje desítky tisíc snímků, SIM potřebuje desítky snímků a STED je technologie skenování, takže rychlost pořízení závisí na velikosti zorného pole." Kromě živých buněk nebo fixních zobrazovacích buněk chtějí někteří vědci také pochopit, jak se předměty pohybují. Stracy se zajímá o pochopení dynamiky biologických systémů v živých buňkách, nejen o statické obrazy. K analýze dynamiky v živých buňkách kombinuje PALM se sledováním jednotlivých částic. Tímto způsobem může přímo sledovat markerové molekuly, jak plní své funkce. Domnívá se však, že SIM není vhodná pro studium těchto dynamických procesů na molekulární úrovni, ale pro svou rychlou akviziční rychlost je vhodná zejména pro pozorování dynamiky větších struktur, jako jsou celé chromozomy. Nejnovější výsledky V roce 2017 Hellův tým ohlásil mikroskop MINFLUX s vysokým rozlišením v Science. Podle Hella tato superrozlišovací metoda poprvé dosahuje prostorového rozlišení 1 nm. Navíc dokáže sledovat jednotlivé molekuly v živých buňkách nejméně 100krát rychleji než jiné metody. Další vědci také chválili mikroskop MINFLUX. "Neustále se vyvíjejí nové aplikace a přístupy, ale dva pokroky mi vynikají," řekl Shechtman. Jedním z nich je MINFLUX. "Využívá důmyslný přístup k získání velmi přesné molekulární polohy." Pokud jde o druhý vzrušující vývoj, Shechtman zmínil WE Moernera a jeho kolegy ze Stanfordské univerzity. Moerner byl také příjemcem Nobelovy ceny za chemii za rok 2014. Jeden z vítězů. Aby se vyřešilo omezení rozlišení zobrazení způsobeného anizotropním rozptylem fluorescenčních jednotlivých molekul, vědci použili různé polarizace excitace k určení orientace a polohy molekul. Navíc mají vyvinuté jemné povrchy zornic. Tyto techniky zlepšují schopnost lokalizovat struktury. O fluorescenčních štítcích V mnoha aplikacích s vysokým rozlišením na štítcích opravdu záleží. Existují také společnosti, které poskytují související produkty. Například německý Miltenyi se spojil se společností Abberior, kterou založil Stefan Hell, aby poskytovala zakázkové služby konjugace protilátek pro barviva pro mikroskopii s vysokým rozlišením. Řada dalších společností také nabízí odpovídající značky. „Naše Nano-Boostery jsou velmi malé, mají pouze 1,5 kDa a jsou vysoce specifické,“ říká Christoph Eckert, marketingový ředitel společnosti ChromoTek. Tyto proteiny váží zelené a červené fluorescenční proteiny (GFP a RFP). Jsou odvozeny z fragmentů protilátek z alpaky, známých jako VHH nebo nanobody, s vynikajícími vazebnými vlastnostmi a stabilní kvalitou bez variací mezi jednotlivými šaržemi. Tyto markery jsou vhodné pro různé techniky s vysokým rozlišením včetně SIM, PALM, STORM a STED. Ai-Hui Tang, odborný asistent na University of Maryland School of Medicine, a kolegové použili ChromoTek GFP-Booster a STORM ke zkoumání šíření informací v nervovém systému. V presynaptických a postsynaptických neuronech našli molekulární nanoklastry, nazývané nanokolony. Vědci se domnívají, že tato struktura ukazuje, že centrální nervový systém využívá jednoduché principy k udržení a regulaci synaptické účinnosti. Různé verze zobrazování v super rozlišení a rostoucí počet metod zavádějí vědce ještě hlouběji do biologických záhad. Prolomením difrakčního limitu viditelného světla mohou biologové dokonce „blízko sledovat“ činnost buněk.
