Aplikace fluorescenční fluorescenční mikroskopie s totálním vnitřním odrazem
TIRFM (Total Internal Reflection Fluorescence Microscope), totální vnitřní reflexní fluorescenční mikroskop, kdy světlo vstupuje do média s nižším indexem lomu z média s vysokým indexem lomu, pokud je úhel dopadu dostatečně velký, veškeré světlo se odráží bez lomu, ale v Rozhraní dvou médií vytváří evanescentní vlny, které mohou vybudit fluorescenci do 100nm blízko rozhraní, aby bylo možné pozorovat povrch objektu. Budící světlo může být posláno přes iluminátor běžného fluorescenčního mikroskopu nebo speciální iluminátor a lze řídit úhel dopadu laseru. K zabránění vstupu excitačního světla do detektoru se používá metoda okamžitého buzení pole. Budící světlo na rozhraní mezi sklem a vodou vytváří plný vnitřek realizovaný odrazem. Vzhledem k exponenciálnímu zeslabení excitačního světla bude fluorescenční odraz produkovat pouze oblast vzorku velmi blízko k úplnému odrazovému povrchu, což výrazně snižuje interferenci šumu pozadí s cílem pozorování, takže tato technologie je široce používána v dynamickém pozorování. látek z buněčného povrchu.
Schematický diagram totální vnitřní reflexní fluorescenční mikroskopie (TIRFM)
①Ukázka ②Evanescenční vlnový rozsah ③Krycí sklo ④Ponoření do oleje ⑤Cíl ⑥Emisní paprsek (signál) ⑦Budicí paprsek
Aby se dosáhlo úplného vnitřního odrazu, je zapotřebí velký úhel dopadu, například úhel dopadu na rozhraní sklo-voda je větší než 61 stupňů. Toho lze dosáhnout hranolem nazývaným TIRFM na bázi hranolu nebo čočkou objektivu s vysokou numerickou aperturou, která se nazývá TIRFM objektivového typu. Současné komercializované totální vnitřní reflexní fluorescenční mikroskopy jsou obecně typu čočky objektivu, s vysokou rychlostí a vysokou přesností.
Totální vnitřní reflexní fluorescenční mikroskopie je široce používána v některých biologických oborech, protože může realizovat fluorescenční pozorování ve velmi tenkém rozsahu (méně než 100 nm) na povrchu objektů. Například následující aplikace:
Pozorování obrazů buněčného povrchu: struktura povrchu buněčné membrány, kontakt s buněčným povrchem, dynamika povrchu membrány/lokalizace proteinů.
Pozorování a manipulace s jednou molekulou: myozin, aktin a Cy3-značený ATP.
Pohyb povrchu buněčné membrány: jako je pohlcení vezikuly, výdech vezikuly a exokrinní vezikuly. a
Pozorování jevu vápníkového jiskření v buněčné membráně, monitorování iontových kanálů.
Molekulární motorický výzkum: rotační motory, cytoskeletální proteiny, polymery, G proteiny, kruhové proteiny, nukleotidové motory.
Kromě oblasti biologie má dobré uplatnění také v oblasti chemie pro pozorování chemických molekulárních struktur.
