Proč potřebujeme konfokální mikroskopii?
1. Po úsilí a vylepšeních našich velkých předchůdců dosáhl optický mikroskop dokonalé úrovně. Ve skutečnosti nám běžné mikroskopy mohou poskytnout krásné mikroskopické snímky jednoduše a rychle. Došlo však k události, která do tohoto téměř dokonalého světa mikroskopů přinesla převratnou inovaci, kterou byl vynález „laserového rastrovacího konfokálního mikroskopu“. Charakteristickým rysem tohoto nového typu mikroskopu je, že využívá optický systém, který pouze extrahuje obrazovou informaci na povrchu, kde je soustředěno ohnisko. Změnou ohniska a obnovením získaných informací v obrazové paměti dokáže získat živé obrazy s kompletní 3D informační inteligencí. Touto metodou lze snadno získat informace o tvaru povrchu, které nelze potvrdit běžnými mikroskopy. Pro typické optické mikroskopy jsou navíc „zvyšování rozlišení“ a „prohlubování ohniskové hloubky“ protichůdné podmínky, zejména při velkém zvětšení. V konfokálních mikroskopech je však tento problém snadno vyřešen.
2. Výhody konfokálních optických systémů
Konfokální optický systém slouží k bodovému nasvícení vzorku a odražené světlo je rovněž přijímáno bodovým snímačem. Když je vzorek umístěn do ohniskové polohy, téměř všechno odražené světlo může dosáhnout snímače. Když se vzorek odchýlí od ohniska, odražené světlo nemůže dosáhnout senzoru. To znamená, že v konfokálním optickém systému bude na výstupu pouze obraz, který se shoduje s ohniskem, a bodové a zbytečné rozptýlené světlo bude odstíněno.
Proč používat laser?
V konfokálních optických systémech se na vzorek aplikuje bodové osvětlení a odražené světlo je rovněž přijímáno bodovým snímačem. Bodové světelné zdroje se proto staly nezbytnými. Laser je velmi bodový zdroj světla. Ve většině případů je světelným zdrojem konfokální mikroskopie laser. Kromě toho, monochromatičnost, směrovost a vynikající tvar paprsku laserů jsou také důležitými důvody pro jejich široké přijetí.
4. Je možné pozorování v reálném čase založené na vysokorychlostním skenování
Laserové skenování využívá Acoustic Optical Reflector (AO) v horizontálním směru a Servo Galvano zrcadlo ve vertikálním směru. Vzhledem k absenci mechanických vibrací v jednotce audio optického zkreslení je možné provádět vysokorychlostní skenování a pozorovat v reálném čase na monitorovací obrazovce. Vysoká rychlost tohoto typu fotoaparátu je velmi důležitým faktorem, který přímo ovlivňuje rychlost ostření a načítání polohy.
5. Vztah mezi ohniskovou polohou a jasem
V konfokálním optickém systému, když je vzorek správně umístěn do ohniskové polohy, je jas vysoký a jas před ním a za ním prudce klesá (plná čára na obrázku 4). Citlivá selektivita této ohniskové roviny je právě principem určení výškového směru a rozšíření ohniskové hloubky v konfokální mikroskopii. Ve srovnání s tím typické optické mikroskopy nevykazují významné změny jasu před a za ohniskovou polohou (tečkovaná čára na obrázku 4).
6. Vysoký kontrast a rozlišení
Typický optický mikroskop se vlivem interference způsobené odraženým světlem odchylujícím se od ohniska překrývá s ohniskovou zobrazovací částí, což má za následek snížení kontrastu obrazu. Naproti tomu v konfokálních optických systémech je rozptýlené světlo mimo ohnisko a rozptýlené světlo uvnitř čočky objektivu téměř úplně odstraněno, čímž se získávají obrazy s velmi vysokým kontrastem. Navíc díky tomu, že světlo prochází čočkou objektivu dvakrát, bodový obraz se nejprve zostřuje, což také zlepšuje rozlišení mikroskopu.
