Princip, vlastnosti a použití fluorescenčního mikroskopu
Princip a strukturální vlastnosti fluorescenčního mikroskopu: fluorescenční mikroskop využívá bodový světelný zdroj s vysokou světelnou účinností k vyzařování určité vlnové délky světla (jako je ultrafialové světlo 3650 palců nebo fialové modré světlo 4200 palců) přes filtrační systém jako excitaci světlo ke stimulaci fluorescence ve vzorku. Poté, co látka emituje fluorescenci různých barev, je pozorována prostřednictvím zvětšení čočky objektivu a okuláru. Tímto způsobem, pod silným kontrastním pozadím, i když je fluorescence velmi slabá, je snadno identifikovatelná a má vysokou citlivost. Používá se především pro výzkum buněčné struktury a funkce a chemického složení. Základní konstrukce fluorescenčního mikroskopu se skládá z běžného optického mikroskopu a některého příslušenství (jako je zdroj fluorescenčního světla, excitační filtr, dvoubarevný dělič paprsků a blokovací filtr atd.). Fluorescenční světelný zdroj – obecně používejte ultra vysokotlakou rtuťovou výbojku (50-200W), která může vyzařovat světlo různých vlnových délek, ale každá fluorescenční látka má excitační vlnovou délku, která produkuje nejsilnější fluorescenci, takže excitační filtr ( Obecně platí, existují ultrafialové, fialové, modré a zelené excitační filtry), které propouštějí pouze excitační světlo určité vlnové délky a ozařují vzorek, zatímco jiné světlo pohlcují. Každá látka je po ozáření excitačním světlem ve velmi krátké době emitována viditelnou fluorescencí s delší vlnovou délkou, než je vlnová délka ozařování. Fluorescence je specifická a obecně slabší než excitační světlo. Aby bylo možné pozorovat specifickou fluorescenci, je zapotřebí blokovací (nebo potlačující) filtr za čočkou objektivu.
Má dvě funkce: jednou je absorbovat a blokovat vstup excitačního světla do okuláru, aby nedošlo k narušení fluorescence a poškození očí; druhým je vybrat a nechat projít specifickou fluorescenci, která ukazuje specifickou fluorescenční barvu. Oba filtry se musí používat společně.
Existují dva typy fluorescenčních mikroskopů z hlediska jejich optických drah:
1. Transmisní fluorescenční mikroskop: Zdroj excitačního světla prochází materiálem vzorku přes kondenzorovou čočku, aby se excitovala fluorescence. Běžně se používá kolektor tmavého pole a obyčejný kolektor lze použít i k nastavení zrcadla tak, aby bylo excitační světlo přesměrováno a přemostěno na preparát. Jedná se o starší fluorescenční mikroskop. Výhodou je, že fluorescence je silná při malém zvětšení, ale nevýhodou je, že fluorescence klesá s rostoucím zvětšením. Proto je lepší pozorovat větší vzorky materiálů.
2. Epi-fluorescenční mikroskop je nový typ fluorescenčního mikroskopu vyvinutý v moderní době. Rozdíl je v tom, že excitační světlo dopadá z čočky objektivu dolů na povrch preparátu, to znamená, že stejná čočka objektivu se používá jako osvětlovací kondenzor a čočka objektivu pro sběr fluorescence. Ve světelné dráze, která je vzdálena 45 stupňů od lehkého uranu, je třeba přidat dichroický dělič paprsku. Budící světlo se odráží do čočky objektivu a shromažďuje se na vzorku. Fluorescence generovaná vzorkem a excitační světlo odražené povrchem čočky čočky objektivu a povrchem krycího skla vstupují do čočky objektivu současně a vracejí se do dvoubarevného rozdělovače paprsku, aby se excitační světlo oddělilo od fluorescence , zbytkové excitační světlo je absorbováno blokovacími filtry. Například přechod na kombinaci různého excitačního filtru/dvoubarevného děliče paprsku/blokovacího filtru může splňovat potřeby různých produktů fluorescenční reakce. Výhodou tohoto typu fluorescenčního mikroskopu je, že osvětlení zorného pole je rovnoměrné, zobrazení je jasné a čím větší zvětšení, tím silnější fluorescence.
Jak používat fluorescenční mikroskop
1. Zapněte zdroj světla a ultravysokotlaká rtuťová výbojka se musí několik minut zahřát, aby dosáhla nejjasnějšího bodu.
2. Transmisní fluorescenční mikroskop potřebuje nainstalovat požadovaný excitační filtr mezi zdroj světla a kondenzor a za čočku objektivu nainstalovat odpovídající blokovací filtr. Epifluorescenční mikroskopy potřebují vložit požadovaný excitační filtr/dvoubarevný dělič paprsků/blokovací filtr do štěrbin v optické dráze.
3. Pozorujte čočkou s malým zvětšením a upravte střed světelného zdroje tak, aby se nacházel ve středu celého osvětlovacího bodu podle seřizovacího zařízení různých modelů fluorescenčních mikroskopů.
4. Umístěte vzorek a po zaostření pozorujte. Při používání je třeba věnovat pozornost: nepozorujte přímo koncový filtr, abyste nepoškodili zrak; při pozorování preparátů olejovou čočkou musíte použít speciální olejovou čočku bez fluorescence; po vypnutí vysokotlaké rtuťové výbojky ji nelze ihned znovu zapnout a je třeba ji otestovat. Po 5 minutách ji lze restartovat, jinak bude nestabilní a ovlivní životnost rtuťové výbojky.
