Hlavní pozorovací metodou optického mikroskopu je fluorescenční pozorování
Jev fluorescence
Fluorescence označuje proces, při kterém fluorescenční látka emituje světlo s delší vlnovou délkou téměř současně, když je ozářena světlem specifické vlnové délky (obrázek 1). Když světlo specifické vlnové délky (excitační vlnová délka) dopadá na molekulu (jako je molekula ve fluoroforu), fotonová energie je absorbována elektrony molekuly. Dále elektrony přecházejí ze základního stavu (S0) do vyšší energetické hladiny, excitovaného stavu (S1'). Tento proces se nazývá excitace①. Elektron zůstane v excitovaném stavu po dobu 10-9–10-8 sekund, během kterých elektron ztratí určitou energii ②. V procesu opuštění excitovaného stavu (S1) a návratu do základního stavu ③ bude uvolněna zbývající energie absorbovaná během procesu buzení.
Doba zdržení fluorescenční molekuly v excitovaném stavu je životnost fluorescence, obecně v nanosekundách, což je vlastní charakteristika fluorescenční molekuly samotné. Technologie zobrazování pomocí fluorescenční životnosti se nazývá Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM), která může kromě zobrazování intenzity fluorescence provádět i hlubší funkční a přesnější měření za účelem získání molekulární konformace, intermolekulárních interakcí a molekulárních mikroprostředí. informace, které je obtížné získat běžným optickým zobrazováním.
Další důležitou vlastností fluorescence je Stokesův posun, rozdíl ve vlnové délce mezi excitačními a emisními vrcholy (obrázek 2). Obvykle je vlnová délka emisního světla delší než vlnová délka excitačního světla. Po excitaci fluorescenční látky a před uvolněním fotonu totiž elektrony ztratí část energie relaxačním procesem. Fluorescenční látky s většími Stokesovými posuny jsou snadněji pozorovatelné pod fluorescenčním mikroskopem.
Fluorescenční mikroskopy a fluorescenční filtrační bloky
Fluorescenční mikroskopie je optický mikroskop, který využívá fluorescenční vlastnosti k pozorování a zobrazování a je široce používán v buněčné biologii, neurobiologii, botanice, mikrobiologii, patologii, genetice a dalších oborech. Fluorescenční zobrazování má výhody vysoké citlivosti a vysoké specificity a je velmi vhodné pro pozorování distribuce specifických proteinů, organel atd. v tkáních a buňkách, studium společné lokalizace a interakce a sledování dynamiky života. procesy, jako jsou změny koncentrace iontů.
Většina molekul v buňkách nefluoreskuje, a aby je bylo možné vidět, musí být fluorescenčně označeny. Existuje mnoho metod fluorescenčního značení, které může být přímo značeno (např. pomocí DAPI pro značení DNA), nebo imunobarvení s využitím vlastností protilátek vázající antigen, nebo může být cílový protein značen fluorescenčními proteiny (např. GFP, zelená fluorescenční protein) nebo reverzibilní vazba. syntetická barviva (jako je Fura-2) atd.
V současné době se fluorescenční mikroskop stal standardním zobrazovacím vybavením různých laboratoří a zobrazovacích platforem a je dobrým pomocníkem pro naše každodenní experimenty. Fluorescenční mikroskopy se dělí především do tří kategorií: vzpřímené fluorescenční mikroskopy (vhodné pro řezy), inverzní fluorescenční mikroskopy (vhodné pro živé buňky, s přihlédnutím k řezům), fluorescenční stereoskopické mikroskopy (vhodné pro větší vzorky, jako jsou rostliny, zebrafish (dospělí/ embryo), medaka, orgány myší/krys atd.).
Blok fluorescenčního filtru je základní součástí fluorescenčního zobrazování v mikroskopech. Skládá se z budícího filtru, emisního filtru a dichroického rozdělovače paprsku. Je instalován ve filtrovém kole, jako je Leica DMi8 vybavený 6-polohovým filtrovým kolem (obrázek 3). ). Různé mikroskopy mají různé polohy koleček a některé mikroskopy používají filtrační sklíčka.
Blok filtru hraje důležitou roli ve fluorescenčním zobrazování: excitační filtr vybírá excitační světlo k excitaci vzorku a blokuje jiné vlnové délky světla; světlo procházející excitačním filtrem prochází dichroickým děličem paprsků (jeho úlohou je odrážet excitační světlo a propouštět fluorescenci), po odrazu je zaostřeno čočkou objektivu, ozářeno na vzorek a příslušná fluorescence je excitována na vyzařovat světlo. Vyzařované světlo je zachycováno čočkou objektivu, prochází přes dichroický dělič paprsku a dostává se k emisnímu filtru. Jak je znázorněno na obrázku 4: excitační vlnová délka je 450-490nm, dichroický dělič paprsků odráží světlo kratší než 510 nm, propouští světlo delší než 510 nm a dosah příjmu emisního světla je 520-560 nm.
Fluorescenční filtry běžně používané ve fluorescenčních mikroskopech lze rozdělit do dvou typů: dlouhý průchod (zkráceně LP) a pásmový průchod (krátce BP). Pásmová propust je obvykle určena centrální vlnovou délkou a šířkou intervalu, například 480/40, což znamená, že světlo od 460-500nm může projít. Longpass filtry, jako je 515 LP, propouštějí světlo s vlnovými délkami delšími než 515 nm (obrázek 5).
Fluorescenční látky mají svou charakteristickou excitační (absorpční) křivku a emisní křivku, excitační vrchol je ideální vlnová délka excitace (vysoká účinnost excitace, která může snížit excitační světelnou energii, chránit buňky a barviva) a emisní křivka je vlnová délka emisní fluorescence rozsah. Proto v experimentu zvolíme vlnovou délku co nejblíže k excitačnímu vrcholu pro buzení a přijímací rozsah potřebuje zahrnovat emisní vrchol. Například excitační pík Alexa Fluor 488 je 500 nm a ve fluorescenčním mikroskopu lze vybrat excitační filtr 480/40.
Podrobnosti o filtračních kostkách lze zobrazit v zobrazovacím softwaru mikroskopu. Pochopení barviv a nalezení filtru, který nejlépe odpovídá vašemu vzorku, je pro fluorescenční zobrazování rozhodující. Spektrální informace fluorescenčních barviv a fluorescenčních proteinů jsou obecně uvedeny v pokynech a lze je také nalézt online.
Kromě vlnových délek excitace a emise fluorescenčních sond je třeba při výběru filtračních bloků také zvážit, zda dochází k nespecifické excitaci a zda existuje křížová barva u vícebarevně značených vzorků. Dále je nutné zvážit použitý zářivkový zdroj světla. V současnosti běžně používané zářivkové světelné zdroje zahrnují rtuťové výbojky, halogenidové výbojky a LED světelné zdroje, které se v posledních letech rychle vyvíjejí. Spektrum fluorescenčního světelného zdroje je spojité nebo nespojité a energie se bude lišit v různých pásmech vlnových délek. LED světelný zdroj se postupně stává hlavním světelným zdrojem fluorescenčního mikroskopu díky svému relativně úzkému spektrálnímu pásmu, stabilnějšímu energetickému výkonu, dlouhé životnosti, bezpečnější a šetrnější k životnímu prostředí a mnoha dalším výhodám.
Kromě vestavěného filtračního bloku mikroskopu je zde také externí rychlé kolečko (obrázek 7). Rychlost konverze filtru sousedícího s externím rychlým kolem Leica je 27 ms, což umožňuje realizovat vysokorychlostní vícebarevné experimenty, jako je zobrazování vápníku s poměrem FRET a Fura2. (obr. 8) a kol.
Široká škála zobrazovacích technik fluorescenční mikroskopie
Aby bylo možné splnit různé potřeby fluorescenčního zobrazování, byla kromě fluorescenčních mikroskopů vyvinuta různá řešení pro zobrazování pomocí fluorescenční mikroskopie:
Širokoúhlé zobrazovací systémy s vysokým rozlišením, jako je Leica THUNDER Imager, využívají inovativní technologii Clearing společnosti Leica k účinnému odstranění interferenčních signálů v neohniskové rovině během zobrazování, poskytují čisté snímky a výhody vysokorychlostního zobrazování;
Konfokální laserový skenovací mikroskop využívá dírky k eliminaci nefokální rovinné interference, realizuje optické řezy a získává obrazy s vysokým rozlišením a trojrozměrné obrazy;
Mikroskopy s ultravysokým rozlišením a nanomikroskopy, které prolomí difrakční mez, mohou pozorovat jemné struktury menší než 200 nm;
Multifotonový zobrazovací systém využívající principu multifotonové excitace pro zobrazování tlusté tkáně a hluboko in vivo;
Technologie zobrazování světelných listů s vysokým časovým a prostorovým rozlišením, vysokou rychlostí zobrazování, vysokým rozlišením, nízkou fototoxicitou, zvláště vhodná pro výzkum vývoje a dynamické pozorování in vivo;
Fluorescenční celoživotní zobrazování (FLIM), které není ovlivněno faktory, jako je koncentrace fluorescenční látky, fotobělení, intenzita excitačního světla atd., může provádět podrobnější funkční a přesnější měření;
Fluorescenční korelační spektroskopie (FCS) a fluorescenční křížová korelační spektroskopie (FCCS) měří molekulární počet a difúzní koeficient fluorescenčních molekul, čímž analyzují molekulární koncentraci, velikost molekul, viskozitu, molekulární pohyb, molekulární vazbu/disociaci a molekulární optické vlastnosti;
Totální vnitřní reflexní fluorescenční mikroskopie (TIRF) s extrémně vysokým rozlišením osy z je ideální pro studium molekulární struktury a dynamiky povrchů buněčných membrán.
