Technické vlastnosti a dovednosti použití dvoufotonového fluorescenčního mikroskopu
Dvoufotonová fluorescenční mikroskopie je nová technologie, která kombinuje laserovou skenovací konfokální mikroskopii a technologii dvoufotonové excitace.
Základní princip dvoufotonové excitace je: v případě vysoké hustoty fotonů mohou fluorescenční molekuly absorbovat dva dlouhovlnné fotony současně a po krátké době života tzv. excitovaného stavu emitovat foton kratší vlnové délky. . ; Účinek je stejný jako při použití fotonu s vlnovou délkou poloviční oproti dlouhé vlnové délce k excitaci fluorescenční molekuly. Dvoufotonová excitace vyžaduje vysokou hustotu fotonů. Aby nedošlo k poškození buněk, používá dvoufotonová mikroskopie vysokoenergetické pulzní lasery s uzamčeným režimem. Laser emitovaný tímto laserem má vysokou špičkovou energii a nízkou průměrnou energii, jeho šířka pulzu je pouze 100 femtosekund a jeho perioda může dosáhnout 80 až 100 megahertzů. Při použití čočky objektivu s vysokou numerickou aperturou k zaostření fotonů pulzního laseru je hustota fotonů v ohnisku čočky objektivu nejvyšší a k buzení dvěma fotony dochází pouze v ohnisku čočky objektivu, takže dvoufotonový mikroskop nepotřebuje konfokální dírku, což zlepšuje účinnost fluorescenční detekce. Jde o významnou výzkumnou metodu v oblasti morfologie, molekulární buněčné biologie, neurovědy a farmakologie.
1. Pozadí vzniku dvoufotonové mikroskopie - dvě omezení tradiční laserové konfokální mikroskopie:
1) Jedním z nich je fenomén fototoxicity: protože konfokální dírka musí být dostatečně malá, aby se získal obraz s vysokým rozlišením, a malá apertura bude blokovat velkou část fluorescence vyzařované ze vzorku, včetně fluorescence vyzařované z ohniskové roviny, odpovídající Ano, budicí světlo musí být dostatečně silné, aby bylo dosaženo dostatečného odstupu signálu od šumu; a laser s vysokou intenzitou způsobí, že fluorescenční barvivo během kontinuálního skenování rychle vybledne a fluorescenční signál bude s postupem skenování stále slabší.
2) Dalším problémem je fototoxicita. Při laserovém ozáření bude mnoho molekul fluorescenčních barviv produkovat cytotoxiny, jako je singletový kyslík nebo volné radikály, takže doba skenování a hustota optického výkonu excitačního světla by měly být v experimentu omezeny, aby se zachovala hustota vzorku. aktivní. Při výzkumu aktivních vzorků, zejména různých fází růstu a vývoje aktivních vzorků, fotobělení a fototoxicita tyto studie velmi omezují.
2. Proč říkáte, že dvoufotonové mikroskopy obecně nemusí být vybaveny ultrafialovými excitačními lasery?
Dvoufotonová mikroskopie je technologie fluorescenční excitace založená na dvoufotonovém excitačním efektu: molekuly fluorescenčního barviva mohou být excitovány pohlcením dvou nízkoenergetických fotonů současně (časový interval mezi dvěma fotony, které dosáhnou fluorescenční molekuly, je kratší než 1 femtosekunda ), jeho excitační efekt může být ekvivalentní absorbci fotonu s vysokou energií o 1/2 vlnové délce. Například absorbce dvou fotonů na červených vlnových délkách je ekvivalentní molekule absorbující ultrafialové záření. Dlouhovlnné fotony nejsou snadno absorbovány buňkami, takže fototoxicita pro živé buňky je snížena a také je sníženo fotobělení. Tímto způsobem plní nejen funkci ultrafialového buzení, ale také zabraňuje poškození vzorku ultrafialovým světlem.
3. Co je zvláštního na laseru dvoufotonového mikroskopu?
Pravděpodobnost absorpce dvou fotonů závisí na tom, jak blízko se oba dopadající fotony shodují v prostoru a čase (dva fotony musí dorazit během 10-18 sekund). Dvoufotonový absorpční průřez je malý a excitovány jsou pouze fluorofory v oblastech s velkým tokem fotonů. Proto většina používaných laserů jsou titanové safírové lasery, které mohou dosahovat pikosekundové nebo femtosekundové rychlosti skenování a mají velmi vysoký špičkový výkon a nízký průměrný výkon, takže fotobělení a fototoxicita mohou být sníženy nebo eliminovány. Nejdůležitější je zajistit velmi vysokou hustotu fotonů v malém rozsahu, která dokáže zajistit současnou excitaci dvou fotonů.
4. Jaké jsou výhody dvoufotonového buzení?
1) Zvyšte selektivitu barviva: rozsah excitačního světla laseru konfokálního systému (Ar, Ar/Kr, HeNe) je 488nm - 647nm. To znamená experimentovat s fluorescenčními barvivy buzenými UV zářením, např. s DAPI , Hoescht. Excitační vlnová délka dvoufotonů je dvojnásobná než jednofotonových, takže barviva excitovaná ultrafialovým zářením mohou být excitována blízkým infračerveným světlem.
2) Snížení fotobělení: Kvůli snížení fotobělení se zvyšuje úspěšnost experimentů používajících CFP/YFP pro přenos fluorescenční rezonanční energie (FRET).
3) Není potřeba žádná speciální čočka objektivu: Z hardwarového hlediska buzení UV-buzených barviv s vlnovou délkou blízkého infračerveného světla nevyžaduje speciální UV optické komponenty.
4) Zlepšení poměru signálu k šumu: vlnová délka excitačního světla a vlnová délka emitovaného světla mají velký rozdíl, což zlepšuje poměr signálu k šumu.
5) Bělení lokalizované v ohnisku: Protože k excitaci fluorescence dochází pouze v ohnisku objektivu, není potřeba konfokální dírka. To zlepšuje detekci světla a fotobělení nastává pouze v ohnisku.
6) Snazší pronikání vzorků: Infračervené světlo vlnové délky není snadno rozptylováno buňkami a může proniknout hlouběji do vzorků.
5. Jaké největší zlepšení přinesla dvoufotonová mikroskopie ve srovnání s laserovou skenovací konfokální mikroskopií?
1) Snížené fotobělení.
2) Snížená fototoxicita.
3) Není snadné jej rozptýlit a je snazší proniknout tlustými vzorky, jako jsou mozkové řezy.
