Požadavky na přípravu vzorků pro fluorescenční mikroskopii
Požadavky na přípravu vzorku pro fluorescenční mikroskopii
(1) Podložní sklíčko
Tloušťka sklíčka by měla být mezi 0.8-L2 mm. Příliš silné sklíčko na jedné straně pohltí více světla a na druhé straně nemůže zaostřit excitační světlo na preparát. Sklíčka musí být hladká, stejnoměrná v tloušťce a bez zjevné autofluorescence. Někdy se používají křemenná sklíčka.
(2) Krycí sklo
Tloušťka krycího skla je asi 0,17 mm, hladké. Pro posílení excitačního světla lze použít i interferenční krycí sklo, což je speciální krycí sklo potažené několika vrstvami látek (např. fluorid hořečnatý), které mají různé interferenční účinky na světlo různých vlnových délek, což může způsobit fluorescence hladká. Excitační světlo prochází skrz a excitační světlo se odráží a toto odražené excitační světlo může excitovat vzorek.
(3) Vzorek
Plátky tkáně nebo jiné vzorky by neměly být příliš silné. Pokud je tloušťka příliš silná, většina excitačního světla bude spotřebována ve spodní části preparátu, zatímco horní část přímo pozorovaná čočkou objektivu nemůže být plně excitována. Kromě toho úsudek ovlivňuje fluorescence způsobená překrývajícími se buňkami nebo nečistotami, nespecifickým barvením pozadí.
(4) zrcadlový olej
Obecně platí, že při pozorování vzorků pomocí fluorescenčních mikroskopů s tmavým polem a olejových imerzních mikroskopů je nutné použít imerzní olej. Nejlepší je použít speciální nefluorescenční imerzní olej. Místo něj lze také použít glycerin a lze použít i tekutý parafín, ale index lomu je nízký, což má mírný dopad na kvalitu obrazu.
Pochopení světelné krychle fluorescenční mikroskopie
Fluorescence je světlo, které elektrony v látce absorbují světelnou energii z nízkoenergetického stavu do vysokoenergetického stavu a poté uvolňují světlo, když se vrátí do nízkoenergetického stavu. Je to světlo nevyzařované teplotou – luminiscence. To znamená: látka absorbuje krátkovlnné světlo, vstoupí do excitovaného stavu a vyzařuje dlouhovlnné světlo.
Ať už jde o autofluorescenci látky, fluorescenční barvivo nebo fluorescenční protein exprimovaný fúzí, musí být excitován specifickou vlnovou délkou světla (Excitace). Poté, co elektrony migrují a ztrácejí energii, emitují světlo specifické dlouhé vlnové délky (emise). , které mohou být shromážděny detekčním systémem pro dosažení funkce identifikace specifické fluorescence.
Co je to fluorescenční světelná krychle?
Při pozorování a zobrazování fluorescenčním mikroskopem poskytuje excitační světlo specifické vlnové délky a odpovídající dlouhovlnné emisní světlo fluorescenční světelná krychle, takže fluorescenční signál lze sbírat pouhým okem, obrazovkou nebo kamerou. Proto fluorescenční světelná kostka určuje, co lze detekovat Klíčové zařízení fluorescenčního signálu, mezi jeho charakteristiky patří EX: parametry filtru excitační vlnové délky, EM: parametry filtru emisní vlnové délky a DM: parametry dichotomického zrcadla. Vezměte si jako příklad světelnou kostku DAPI integrovaného fluorescenčního mikroskopu Revolve, EX: 385/30, EM: 450/50, DM: 425.
The light emitted by the light source passes through DAPI EX to obtain excitation light in a specific wavelength range, that is, light of 385±15nm, which specifically excites fluorescent substances that can only be excited within this range; the DM dichroic mirror separates the excitation light from the fluorescence Optical elements, as special mirrors, reflect only specific wavelengths of light and allow all other wavelengths to pass through, so only >425nm světlo může být přenášeno do EM; EM emisní filtry se používají k oddělení fluorescence emitované fluoroforem od ostatního pozadí Optické prvky pro separaci světla. Emisní filtry propouštějí světlo na vlnové délce fluorescence přes dichroické zrcadlo a zároveň blokují veškeré ostatní světlo, které uniká ze zdroje excitačního světla (odraženého od vzorku nebo optiky). Vlnová délka emitovaného světla je větší než pozorovaná EM, to znamená, že do detekčního systému vstupuje pouze světlo v rozsahu 450 ± 25 nm. Správný výběr EX, EM filtrů a DM dichotomií může výzkumníkům pomoci dosáhnout vyšších poměrů signálu k šumu (S/N).
