Posouvání limitů mikroskopie s vysokým rozlišením: samonastavitelná mikroskopie
Ultra-přesná mikroskopie, která překračuje omezení nositele Nobelovy ceny za super-rozlišovací mikroskop, umožní vědcům přímo měřit vzdálenosti mezi jednotlivými molekulami.
Lékařští vědci z University of New South Wales dosáhli bezprecedentního rozlišení v mikroskopii s jednou molekulou, aby detekovali interakce mezi jednotlivými molekulami v intaktních buňkách.
Nobelova cena za chemii za rok 2014 byla udělena za vývoj technologie fluorescenční mikroskopie s vysokým rozlišením, která poskytla mikroskopům první molekulární pohled do nitra buňky, což je funkce, která poskytuje nové molekulární pohledy na složité biologické systémy a procesy.
Nyní byly detekční limity jednomolekulární mikroskopie znovu posunuty a podrobnosti byly zveřejněny v posledním vydání Science Advances.
Bylo možné pozorovat a sledovat jednotlivé molekuly pomocí mikroskopů s ultravysokým rozlišením, ale k interakcím mezi těmito molekulami dochází v měřítku, které je nejméně čtyřikrát menší než to, které rozlišují existující mikroskopy s jednou molekulou.
"Důvod, proč mají mikroskopy s jednou molekulou obvykle přesnost lokalizace kolem 20 až 30 nanometrů, je obvykle ten, že se mikroskop při detekci signálů skutečně pohybuje. To vede k nejistotě. Pomocí stávajících přístrojů s vysokým rozlišením se nám nepodaří určit, zda je jeden protein vázán na další proto, že vzdálenost mezi nimi je kratší než nejistota v jejich pozicích."
K vyřešení tohoto problému vytvořil tým automatizovanou zpětnovazební smyčku uvnitř jednomolekulárního mikroskopu, která detekuje a přerovnává optickou dráhu a zrcadlový stupeň.
"Nezáleží na tom, co s tímto mikroskopem děláte, v podstatě najde zpětnou cestu s nanometrovou přesností. Je to chytrý mikroskop. Dokáže vše, co operátor nebo servisní technik potřebuje, a to 12krát za sekundu." " řekl prof. Goss.
Měření vzdálenosti mezi proteiny
S návrhem a metodologií nastíněnou v tomto dokumentu navrhl tým UNSW systém zpětné vazby, který je kompatibilní se stávajícími mikroskopy a poskytuje maximální flexibilitu pro přípravu vzorků.
"Toto je velmi jednoduché a elegantní řešení velkého zobrazovacího problému. Právě jsme postavili mikroskop uvnitř mikroskopu a vše, co jsme udělali, bylo zarovnat hlavní mikroskop. Jednoduchost a praktičnost řešení, které jsme našli, je jeho skutečná síla. Je snadné jej klonovat systém a rychle přijímat nové technologie." řekl prof. Goss.
Aby vědci demonstrovali užitečnost svého ultrapřesného zpětnovazebního jednomolekulárního mikroskopu, použili jej k přímému měření vzdálenosti mezi signálními proteiny v T buňkách. Společným předpokladem v buněčné imunologii je, že tyto imunitní buňky zůstávají v klidu, když je receptor T-buněk blízko jiné molekuly, která působí jako brzda.
Jejich vysoce přesná mikroskopie dokázala prokázat, že tyto dvě signální molekuly byly ve skutečnosti v aktivovaných T buňkách od sebe dále odděleny, uvolnily brzdu a zapnuly signalizaci receptorů T buněk.
Prof. Goss řekl: "Konvenční mikroskopické techniky by nebyly schopny přesně změřit tak malou změnu, protože vzdálenost mezi těmito signálními molekulami v klidových a aktivovaných T buňkách se liší pouze o 4-7 nanometrů."
"To také ukazuje, jak citlivé jsou tyto signalizační mechanismy na prostorovou izolaci. Abychom identifikovali takové regulační procesy, potřebujeme provádět přesná měření vzdálenosti, což tento mikroskop umožňuje. Tyto výsledky ilustrují, že tato technologie je v procesu objevování a nelze ji vyrobit v žádném jiná cesta."
