Principy laserové konfokální mikroskopie (LSCM)
Laserový konfokální mikroskop využívá osvětlovací dírku umístěnou za zdrojem světla a detekční dírku umístěnou před detektorem k dosažení bodového osvětlení a bodové detekce. Světlo ze světelného zdroje je zaostřeno na bod v ohniskové rovině vzorku světlem emitovaným skrz osvětlovací dírku a fluorescence vyzařovaná z tohoto bodu je zobrazena uvnitř detekční dírky a jakékoli vyzařované světlo mimo tento bod je blokováno detekční dírka. Osvětlovací dírka a detekční dírka jsou konjugovány pro osvětlený nebo detekovaný bod, takže detekovaný bod je konfokální bod a rovina, kde se nachází detekovaný bod, je konfokální rovina. Počítač zobrazí detekovaný bod na obrazovce počítače ve formě obrazového bodu. Aby se vytvořil úplný obraz, skenovací systém v optické dráze snímá přes ohniskovou rovinu vzorku, čímž se vytvoří úplný konfokální obraz. Dokud se nosný stolek pohybuje nahoru a dolů podél osy Z, přesune se nová úroveň vzorku do konfokální roviny a nová úroveň vzorku se zobrazí na monitoru, zatímco osa Z pokračuje v pohybu. pohybem se získají po sobě jdoucí světlem řezané obrazy různých úrovní vzorku.
Tradiční optický mikroskop využívá polní světelný zdroj, obraz každého bodu na preparátu bude rušen difrakcí nebo rozptylem světla od sousedních bodů; laserový skenovací konfokální mikroskop využívá laserový paprsek procházející osvětlenou dírkou k vytvoření bodového zdroje světla na vzorku snímaném v každém bodě vnitřní ohniskové roviny, vzorek na ozařovaném bodě, zobrazení detekční dírky detekcí dírky po bodové multiplikační trubici (PMT) nebo studeném elektrocouplovaném zařízení (cCCD) přijatém bod po bodu nebo řádek po řádku se na obrazovce počítačového monitoru rychle vytvoří fluorescenční obraz. Osvětlovací dírka a detekční dírka vzhledem k ohniskové rovině čočky objektivu jsou sdružené, bod na ohniskové rovině je současně zaostřen na osvětlovací dírku a emisní dírku, bod mimo ohniskovou rovinu nebude při detekci dírkou na zobrazení, takže získaný konfokální obraz je optickým průřezem vzorku, čímž se překonávají nedostatky obrazu běžného mikroskopu fuzzy.
Ze základního principu je laserový konfokální mikroskop moderní optický mikroskop, je to obyčejný světelný mikroskop z technologie, která umožňuje následující vylepšení.
1. Jako zdroj světla používejte laser, protože monochromatičnost laseru je velmi dobrá, vlnová délka paprsku zdroje světla je stejná, což zásadně eliminuje chromatickou aberaci.
2. Použití konfokální technologie v ohniskové rovině objektivu umístěné uprostřed s malým otvorem v přepážce, ohnisková rovina mimo rozptylové světlo blokuje, eliminuje sférickou aberaci; a dále eliminovat chromatickou aberaci.
3. Laserový konfokální mikroskop využívající technologii bodového skenování k rozkladu vzorku do dvourozměrného nebo trojrozměrného prostoru do bezpočtu bodů, s velmi malým laserovým paprskem (bodovým světelným zdrojem) bod po bodu, řádek po řádku skenovacím zobrazováním a poté přes mikropočítačová kombinace celé roviny nebo trojrozměrného obrazu. Tradiční světelný mikroskop je světelný zdroj pole pod jednorázovým zobrazením, vzorky v každém bodě obrazu budou sousedit s bodem ohybového světla a interference rozptýleného světla. Jasnost a přesnost těchto dvou snímků nelze srovnávat.
4. Získávání a zpracování optických signálů počítačem a zesílení signálů fotonásobičem
V laserovém konfokálním mikroskopu počítač nahrazuje pro pozorování a záznam videa lidské oko nebo kameru a získané snímky jsou digitalizovány a lze je zpracovat v počítači, aby se opět zlepšila jasnost snímků. Navíc použití fotonásobičů může zesílit velmi slabé signály, čímž se výrazně zlepší citlivost. V důsledku kombinovaného použití výše uvedených technologií lze říci, že LSCM je nejpokročilejší mikroskop na světě. Dá se říci, že LSCM je spojením technologie výroby mikroskopu, fotoelektrické technologie, výpočetní techniky**, je nevyhnutelným produktem vývoje moderních technologií.
