Učebna mikroskopického zobrazování – Aplikace fluorescenční mikroskopie
Totální vnitřní reflexní fluorescenční mikroskopie (TIRFM) je technika, která využívá evanescentní vlnu generovanou světelným paprskem šířícím se mezi dvěma různými médii indexu lomu k sondování povrchu fluorescenčně značených živých buněk. V praxi, když dopadající laserový paprsek narazí na rozhraní mezi krycím sklíčkem a vodným médiem obsahujícím buňky, odrazí se pod kritickým úhlem (totální vnitřní odraz). Protože energie evanescentní vlny klesá exponenciálně se vzdáleností od krycího sklíčka, jsou evanescentní vlnou excitovány pouze fluorofory do 10 nanometrů od povrchu (mezi 10 a 200 nanometry), zatímco fluorofory vzdálenější jsou z velké části nevybuzené. Postižený. Výsledkem TIRFM jsou tedy vysoké úrovně signálu z fluoroforů umístěných v blízkosti krycího sklíčka, superponovaných na velmi tmavém pozadí, což poskytuje vynikající poměr signálu k šumu. Extrémní omezení hloubky excitace je ideální pro studium jednotlivých molekul nebo složení membrán a organel v adherentních buňkách blízko povrchu krycího sklíčka (viz obrázek 8(e)). Protože excitace je omezena na tenké oblasti blízko krycího sklíčka, fotobělení a fototoxicita jsou také omezeny na tyto oblasti, což z TIRFM činí jednu z nejužitečnějších metod pro dlouhodobé pozorování. Tato technika se stala základním nástrojem pro studium široké škály jevů v buněčné a molekulární biologii.
Dekonvoluce je algoritmus aplikovaný na sadu celofokusových obrazů pořízených podél optické (Z) osy pro zesílení fotonového signálu v hromadě obrazů pro danou obrazovou rovinu nebo více ohniskových rovin. Mikroskopy musí být vybaveny vysoce přesnými motorizovanými zaostřovacími pohony, aby bylo zaručeno získávání obrazu v přesně definovaných intervalech mezi ohniskovými rovinami vzorku. V typické aplikaci (viz obr. 8(f)) se dekonvoluční proces používá k rozmazání a odstranění neostrého světla z dané ohniskové roviny pomocí širokoúhlé fluorescenční excitace a emise. Nejsložitější aplikací je aplikovat proces dekonvoluce na celý zásobník obrázků za účelem generování promítaných pohledů nebo 3D modelů. Sada širokoúhlých snímků používaných pro dekonvoluci zachycuje teoretický maximální počet fotonů emitovaných vzorkem. Proces dekonvoluce redistribuuje "rozmazané" intenzity fotonů emitovaných nad a pod ohniskovou rovinou zpět do původní roviny. Dekonvoluce tedy využívá téměř všechny dostupné intenzity vyzařování a poskytuje optimální světelný rozpočet, díky čemuž je tato technika metodou volby pro vzorky velmi citlivé na světlo.
Pro získání kvantitativní časové a prostorové informace o vazbě a interakci proteinů, lipidů, enzymů a nukleových kyselin v živých buňkách se používá varianta jevu přenosu rezonanční energie ve fluorescenční mikroskopii, fluorescence nebo Försterově rezonančním přenosu energie (FRET). FRET může využívat buď techniky konstantního stavu nebo časově rozlišené techniky, ale časově rozlišené FRET zobrazování má výhodu přesnějšího mapování vzdáleností dárce-akceptor. Pro FRET zobrazení lze použít standardní širokoúhlý fluorescenční mikroskop vybavený příslušnými excitačními a emisními filtry a citlivou kamerou. Biosenzory, které vkládají environmentálně citlivý protein nebo peptid mezi dva fluorescenční proteiny použitelné FRET, jsou v současné době široce používány v buněčné biologii. Tyto sondy lze snadno zobrazit pod širokoúhlou fluorescenční mikroskopií s použitím technik FRET senzibilizované emise v kombinaci s poměrovou analýzou. Kromě toho může spektrální zobrazování a lineární rozmíchání pomocí laserové skenovací konfokální mikroskopie pomoci monitorovat jevy FRET v biosenzorech a dalších aplikacích fluorescenčních proteinů.
Fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) je důmyslná technika schopná současně zaznamenávat životnost fluorescence a prostorové umístění fluoroforu v každém místě snímku. Tato metoda poskytuje mechanismus pro studium parametrů prostředí, jako je pH, koncentrace iontů, polarita rozpouštědla, nekovalentní interakce, viskozita a napětí kyslíku v jednotlivých živých buňkách, a prezentuje data v prostorových a časových polích. FLIM měření životnosti excitovaného stavu na nanosekundové stupnici jsou nezávislá na lokálních koncentracích fluoroforů, efektech fotobělení a délce dráhy (tloušťka vzorku), ale jsou citlivá na reakce excitovaného stavu, jako je přenos rezonanční energie. Ve skutečnosti je kombinace FLIM s FRET sledováním celoživotních změn fluorescenčních dárců před a po přenosu rezonanční energie považována za jeden z nejlepších způsobů, jak tento fenomén studovat.
Mobilita (koeficient příčné difúze) fluorescenčně značených makromolekul a malých fluoroforů může být stanovena technikou obnovení fluorescence po fotobělení (FRAP). Ve FRAP je velmi malá vybraná oblast (několik mikrometrů v průměru) intenzivně osvětlena, obvykle laserem, aby došlo k úplnému vyblednutí fluoroforu v této oblasti světlem. Výsledkem je dramatické snížení nebo zničení fluorescence. Po pulsu fotobělení byla sledována rychlost a rozsah obnovy intenzity fluorescence v odbarvených oblastech jako funkce času při nízkých intenzitách excitace, aby se získaly informace o kinetice opětovného osídlení a obnovy fluoroforů (obrázek 9). FRAP se obvykle provádí pomocí EGFP nebo jiných fluorescenčních proteinů. Související fotoaktivační techniky jsou založeny na speciálních syntetických klecových fluoroforech nebo podobně funkčních fluorescenčních proteinech, které lze aktivovat krátkými pulzy UV nebo fialové. Fotoaktivace a FRAP mohou být použity jako doplňkové techniky ke stanovení parametrů mobility.
V technice související s FRAP, nazývané ztráta fluorescence po fotobělení (FLIP), definovaná fluorescenční oblast v živé buňce prochází opakovaným fotobělením intenzivním ozařováním. Pokud by všechny fluorofory byly schopny během měřeného časového období difundovat do oblasti, která je bělena světlem, vedlo by to k úplné ztrátě fluorescenčního signálu v celé buňce. Výpočtem rychlosti, kterou fluorescence mizí z celé buňky, lze určit difuzní mobilitu cílového fluoroforu. Kromě toho může FLIP snadno identifikovat umístění a povahu jakýchkoli difúzních bariér mezi jednotlivými kompartmenty buněk, jako je bariéra mezi somou a axonem neuronu.
Fluorescenční korelační spektroskopie (FCS), používaná hlavně v laserové skenovací konfokální mikroskopii nebo multifotonové mikroskopii, je metoda určená ke stanovení kinetických informací, jako jsou rychlosti chemické reakce, difúzní koeficienty, techniky pro molekulovou hmotnost, průtok a agregaci. V FCS je malý objem (přibližně jeden femtometr; difrakčně omezené ohnisko laseru) osvětlen zaostřeným laserovým paprskem, aby se zaznamenaly fluktuace intenzity autofluorescence vyvolané dynamikou fluorescenčních molekul jako funkce času v objemu obsazeném fluorescencí. molekul (obr. 10). Relativně malé fluorofory rychle difundují v osvětleném objemu a vytvářejí krátké záblesky náhodné intenzity. Naopak větší komplexy (fluorofory vázané na makromolekuly) se pohybují pomaleji a produkují delší, trvalejší časově závislé vzory intenzity fluorescence.
Když jsou fluorescenčně značené struktury hustě zabaleny a překrývají se ve specifických oblastech živých buněk, je obtížné analyzovat jejich dynamiku a prostorovou distribuci. Fluorescenční bodová mikroskopie (FSM) je technika kompatibilní s téměř všemi zobrazovacími modalitami, která využívá velmi nízké koncentrace fluorescenčně značených podjednotek, snižuje fluorescenci mimo ohnisko a zlepšuje viditelnost značených struktur a jejich dynamiku v tlustých oblastech. FSM jsou implementovány označením pouze zlomku celé struktury zájmu. V tomto smyslu je FSM podobné provádění FCS v celém zorném poli, i když klade větší důraz na prostorové vzorce spíše než na kvantitativní časovou analýzu. Fluorescenční bodová mikroskopie je zvláště užitečná při určování mobility a agregace cytoskeletálních elementů, jako je aktin a mikrotubuly v hyperaktivních buňkách.
Mikroskopie se stimulovanou emisní deplecí (STED) je nově vznikající technika s vysokým rozlišením s prostorovým rozlišením daleko za hranicí difrakce, využívající prstencovité ochuzené světlo k obklopení menšího paprsku excitačního světla, aby se získalo sub-50 nm na ose. rozlišení. Technika spoléhá na excitaci fluoroforů synchronizovanými laserovými pulzy a prostorově koordinovanými kruhovými pulzy STED, které vyčerpávají emitované světlo a potlačují fluorescenci excitovaných molekul kolem laserového skenovacího ohniska. Fluorescence generovaná na okraji skvrny je potlačena, ale ne ve středu skvrny, čímž se významně zmenšuje velikost fluorescenční skvrny a odpovídajícím způsobem se výrazně zvyšuje rozlišení. STED se ukázal jako užitečný nástroj pro detekci živých buněk s vysokým rozlišením. Další nově vznikající techniky s vysokým rozlišením, jako je fotoaktivovaná lokalizační mikroskopie (PALM) a strukturovaná světelná iluminační mikroskopie (SIM), se také stanou základními nástroji pro zobrazování živých buněk v blízké budoucnosti.
Rostoucí používání geneticky kódovaných fluorescenčních proteinů a pokročilých syntetických fluoroforů pro zobrazování živých buněk otevírá dveře novým optickým modalitám pro monitorování časové dynamiky a prostorových vztahů. Mikroskopisté nyní disponují kompletní sadou nástrojů pro pozorování a záznam obrazových dat buněčných procesů probíhajících v širokém rozmezí časových řad a v různých rozlišeních. Pomalejší děje lze snadno pozorovat a zaznamenávat pomocí laserové skenovací konfokální mikroskopie, zatímco rychlejší kinetické děje lze získat pomocí technologie rotujícího disku. Navíc multifotonová mikroskopie umožňuje hloubkové zobrazování v tlustých tkáních a techniky totálního vnitřního odrazu umožňují sondování povrchů membrán s konfokální přesností. Pokročilé fluorescenční metody, jako je FRET, FLIM, FRAP, FCS, FSM, SIM, PALM a STED, lze použít k monitorování interakcí protein-protein v rozlišení často lepším, než umožňuje difrakční limit. S pokroky v technologii fluoroforů, mikroskopů a detektorů se „pod mikroskop“ dostane širší svět.
