Metody pro rozšíření ohniskové hloubky multifotonových mikroskopů
Kombinace dvou-fotonového laserového skenovacího mikroskopu a vápníkového indikátoru je zlatým standardem pro detekci neuronových signálů in vivo. Neurony v neuronových sítích jsou rozmístěny v trojrozměrném-prostoru a sledování dynamiky jejich aktivity vyžaduje způsob, jak rychle zlepšit rychlost objemového zobrazování. Při použití mřížkového rastrovacího multifotonového mikroskopu k zobrazení velkého počtu snímků, pokud se však použije objektiv s vysokou numerickou aperturou (NA) pro dosažení vyššího laterálního rozlišení, bude mít za následek menší ohniskovou hloubku. Chcete-li získat objemové zobrazení v malé hloubce ohniska,
Je nutné provést skenování osy Z{0}} pomocí některých prostředků, přičemž se skenováním každé ohniskové roviny zobrazí mnoho rovin, což značně omezuje rychlost zobrazování. Pokud lze obětovat axiální obrazové informace a lze dosáhnout objemového skenování v jednom laterálním skenování rozšířením hloubky zaostření, to znamená, že objemová informace je promítnuta na jediný 2D obraz, lze rychlost zobrazování výrazně zlepšit. Toto se nazývá zobrazení rozšířené hloubky zaostření (EDF), které je zvláště užitečné pro zobrazení struktur řídké populace, které vyžadují vysoké časové rozlišení, jako je funkční zobrazení neuronální aktivity.
Axiální a laterální rozlišení mikroskopu je určeno numerickou aperturou (NA) čočky objektivu. Vysoká NA může maximalizovat axiální a laterální rozlišení a také množství shromážděného světla; Nižší NA bude mít za následek nižší axiální rozlišení, tj. delší hloubku ostrosti, ale zároveň obětuje laterální rozlišení a účinnost sběru světla. Způsob rozšíření hloubky ostrosti, který bude představen dále, toho může dosáhnout při zachování vysokého bočního rozlišení a dostatečného světelného toku.
Použití prostorových modulátorů světla pro generování ohniskových štíhlých Besselových paprsků může dosáhnout EDF zobrazení, ale modulátory prostorového světla jsou objemné a obtížně kompatibilní s úzkými prostory mikroskopů; Naproti tomu Besselovy moduly založené na axiálních pyramidách jsou levné a kompaktní, ale mohou generovat pouze ohniska s pevnou hloubkou a nejsou vhodné pro různé experimenty, které vyžadují neustálé změny ohniskové hloubky. K řešení tohoto problému v roce 2018 RONGWEN LU et al. demonstroval Besselův modul založený na axikonu, ve kterém je třeba pouze jednu čočku posouvat podél optické osy, aby se plynule nastavila axiální délka Besselova ohniska.
Obrázek 1 (a) Schéma zařízení Besselova modulu; (b) Funkce bodového rozpětí byla experimentálně měřena, když D bylo -12 mm, 0 mm a 12 mm, v daném pořadí; (c) Vztah mezi boční plnou šířkou v polovině maxima, (d) axiální plnou šířkou v polovině maxima, (e) špičkovým signálem a (f) optickou mohutností za čočkou objektivu s posunem L2 D
Modulové zařízení pro vytvoření Besselova ohniska s proměnnou délkou je znázorněno na obrázku 1a. Dopadající Gaussův paprsek je po průchodu axikonem a čočkou L1 tvarován do kruhového paprsku. Následná maska s kruhovou aperturou může blokovat rozptýlené světlo způsobené axikonovými defekty, a tím utvářet axiální distribuci dvou -fotonových funkcí rozšíření bodu excitace. Poté je světelný paprsek promítán na galvanometr čočkami L2 a L3 a poté dosáhne zadní ohniskové roviny čočky objektivu čočkami L4 a L5.
Tyto konstrukce jsou podobné tradičním pyramidovým modulům s tím rozdílem, že pohybem L2 nebo L3 podél optické osy lze plynule upravovat axiální délku Besselova ohniska. Obrázek 1b ukazuje funkce axiálního rozprostření bodu pro hodnoty D -12 mm, 0 mm a 12 mm, s axiální plnou šířkou v polovině maxima 39? m, 24? M a 14? m Jak je znázorněno na obrázku 1c-f, pohybem čočky L2 zleva doprava lze plynule měnit celou šířku v polovině maxima v příčném i axiálním směru, což znamená, že lze plynule měnit hloubku ostrosti. Výsledky numerické simulace založené na teorii vektorové difrakce jsou v dobré shodě s experimentálními daty. Obrázek 2 ověřuje korekční účinek různých velikostí prstencových masek na axikonové defekty. Bylo zjištěno, že tenčí prstencové masky mohou lépe optimalizovat rozložení axiální intenzity výstupního Besselova paprsku, ale současně také vedou k větším ztrátám výkonu.
