Nízkonákladový design fluorescenčního mikroskopu a mikroskopu s jasným polem
V této příručce zopakuji základní principy fluorescenční mikroskopie a jak sestrojit tři různé levné fluorescenční mikroskopy. Tyto systémy obvykle stojí tisíce dolarů, ale nedávné snahy usnadnily jejich získání. Design, který zde představuji, využívá chytré telefony, dSLR a USB mikroskopy. Všechny tyto konstrukce lze také použít jako mikroskopy s otevřeným polem.
Krok 1: Přehled fluorescenční mikroskopie
Abyste porozuměli základním pojmům fluorescenční mikroskopie, představte si husté lesy, stromy, zvířata, keře a další lesy, které žijí v lese v noci. Posvítíte-li baterkou do lesa, uvidíte všechny tyto struktury a je těžké si představit konkrétní živočichy nebo rostliny. Za předpokladu, že máte zájem vidět v lese pouze keře borůvek. Abyste toho dosáhli, je třeba vycvičit světlušky, aby je přitahovaly pouze keře borůvek, takže při pohledu do lesa se rozzáří pouze keře borůvek. Dá se říci, že jste borůvkové keře označili světluškami, takže můžete vidět struktury borůvek v lese.
V této analogii les představuje celý vzorek, borůvkový keř představuje strukturu, kterou chcete zobrazit (například specifické buňky nebo subcelulární organely), a světlušky jsou fluorescenční sloučeniny. Situace natáčení samotné baterky bez světlušek je podobná jako u mikroskopu ve světlém poli.
Dalším krokem je pochopení základních funkcí fluorescenčních sloučenin (také známých jako fluorofory). Fluorescenční shluky jsou vlastně malé objekty (nanoměřítky) určené k propojení konkrétních struktur ve vzorku. Absorbují světlo úzkého rozsahu vlnových délek a znovu vyzařují světlo jiné vlnové délky. Například fluorescenční skupina může absorbovat modré světlo (tj. fluorescenční skupina je excitována modrým světlem) a poté znovu emitovat zelené světlo. Obvykle se to shrnuje prostřednictvím excitačních a emisních spekter (jak je znázorněno na obrázku výše). Tyto grafy ukazují vlnové délky světla absorbovaného fluoroforem a vlnové délky světla emitovaného fluoroforem.
Konstrukce mikroskopu je velmi podobná konstrukci běžného mikroskopu s otevřeným polem, se dvěma hlavními rozdíly. Za prvé, světlo osvětlující vzorek musí mít vlnovou délku excitované fluorescenční skupiny (pro příklad výše je světlo modré). Za druhé, mikroskop potřebuje pouze sbírat emitované světlo (zelené světlo) a blokovat modré světlo. Je to proto, že modré světlo je všude, ale zelené světlo pochází pouze ze specifických struktur ve vzorku. K blokování modrého světla mají mikroskopy obvykle něco, čemu se říká dlouhý propustný filtr, který umožňuje průchod zeleného světla bez modrého světla. Každý dlouhý propust má mezní vlnovou délku. Pokud je vlnová délka světla větší než mezní vlnová délka, může procházet filtrem. Proto je název „Long Distance Pass“. Kratší vlnové délky jsou blokovány.
Krok 2: Modelování mikroskopu pomocí optické optiky
Toto je další krok při navrhování základního principu mikroskopu. Není potřeba stavět fluorescenční mikroskop, takže pokud se nechcete vrtat do optiky, můžete to přeskočit.
Mikroskopy ve světlém poli i fluorescenční mikroskopy lze modelovat pomocí paprskových optických zařízení. Základním předpokladem paprskové optiky je, že chování světla je podobné jako u světla šířícího se od zdroje světla. Když se rozhlédnete po místnosti, uvidíte sluneční světlo za oknem nebo světlo, které přináší žárovka. Poté je světlo absorbováno nebo odráženo předměty v místnosti. Některé odražené světlo způsobí, že bude směřovat k vašim očím. Pokud je objekt osvětlen, můžete si představit, že každý bod na objektu vyzařuje světlo ve všech směrech (jak je znázorněno na obrázku výše). Čočka, stejně jako čočka v našich očích, zaostřuje světlo do bodu, abychom mohli vidět předmět. Bez čočky se světlo dále šíří ven a nevytváří obraz.
