Znalost konfokálního fluorescenčního mikroskopu
Základní princip konfokální fluorescenční mikroskopie: k ozařování preparátu se používá bodový světelný zdroj, který tvoří malý, dobře definovaný bod světla na ohniskové rovině; fluorescence emitovaná z tohoto bodu po ozáření je shromažďována čočkou objektivu a posílána zpět po původní světelné dráze ozařování do děliče paprsků sestávajícího z obousměrného chromatického zrcadla. Dělič paprsku posílá fluorescenci přímo do detektoru. Jak světelný zdroj, tak detektor mají každý před sebou dírku, která se nazývá dírka osvětlení a detekční dírka. Oba mají stejnou geometrii, asi 100-200 nm, a jsou konjugované s ohledem na bod světla v ohniskové rovině, tj. bod světla prochází řadou čoček a nakonec může být zaostřen na obě osvětlující a dírky detektoru. Tímto způsobem se světlo z ohniskové roviny může sbíhat uvnitř otvoru sondy, zatímco rozptýlené světlo nad nebo pod ohniskovou rovinou je blokováno mimo otvor sondy a nelze jej zobrazit. Laser snímá vzorek bod po bodu a trubice fotonásobiče po detekci dírky také získá konfokální obraz odpovídajícího světelného bodu bod po bodu, který je převeden na digitální signál a přenesen do počítače a nakonec se sblíží do čistého konfokální obraz celé ohniskové roviny na obrazovce.
Každý snímek ohniskové roviny je ve skutečnosti optickým řezem preparátem a tento optický řez má vždy určitou tloušťku, také známou jako optická fólie. Protože intenzita světla v ohniskovém bodě je mnohem větší než v neohniskovém bodě a světlo v neohniskové rovině je odfiltrováno dírkou, hloubka pole konfokálního systému je aproximována na nulu a skenování podél směru osy Z umožňuje optické tomografii vytvořit dvourozměrný optický řez vzorku, který lze pozorovat v ohnisku. Kombinací skenování v rovině XY (ohnisková rovina) se skenováním v ose Z (optická osa) lze získat trojrozměrný obraz vzorku shromažďováním postupných vrstev dvourozměrných obrazů, které jsou zpracovávány specializovaným počítačovým softwarem.
To znamená, že detekční dírka a dírka světelného zdroje jsou vždy zaostřeny na stejný bod, takže fluorescence excitovaná mimo ohniskovou rovinu nemůže vstoupit do detekční dírky.
Pracovní princip laserového konfokálu je jednoduše vyjádřen tak, že používá laser jako zdroj světla na základě tradičního zobrazování pomocí fluorescenčního mikroskopu, přídavného laserového skenovacího zařízení a konjugovaného zaostřovacího zařízení prostřednictvím počítačového řízení k provádění digitálního systému získávání a zpracování obrazu.
