Úvod do hlavních aplikačních oblastí optického mikroskopu
Optický mikroskop je starověký a mladý vědecký nástroj. Má za sebou 300 let dlouhou historii od svého vzniku. Optický mikroskop má široké využití. Například v biologii, chemii, fyzice, astronomii atd. je v některých vědeckovýzkumných pracích neodmyslitelný od mikroskopu.
Podle různých aplikačních účelů lze mikroskopy zhruba rozdělit do čtyř kategorií: biologické mikroskopy, metalografické mikroskopy, stereomikroskopy a polarizační mikroskopy. Jak název napovídá, biologické mikroskopy se používají především v biomedicíně a pozorovacími objekty jsou většinou průhledná nebo průsvitná mikrotělesa; metalografické mikroskopy se používají především k pozorování povrchu neprůhledných předmětů, jako je metalografická struktura a povrchové vady materiálů; zatímco stereoskopické mikroskopy zvětšují mikroobjekty, vytvářejí také objekty a obrazy ve stejném směru vzhledem k lidskému oku a mají smysl pro hloubku, což je v souladu s konvenčními vizuálními návyky lidí; polarizační mikroskopy využívají přenosové nebo odrazové charakteristiky různých materiálů pro polarizované světlo k rozlišení různých složek mikroobjektů. Některé speciální typy lze navíc dále dělit. Například inverzní biologický mikroskop nebo kultivační mikroskop je biologický mikroskop používaný hlavně k pozorování kultury přes dno kultivační nádoby; fluorescenční mikroskop využívá vlastnosti určitých látek k absorpci světla o specifické kratší vlnové délce a vyzařování světla o specifické delší vlnové délce k odhalení existence těchto látek a stanovení jejich obsahu; srovnávací mikroskop může vytvářet vedle sebe nebo superponované obrazy dvou objektů ve stejném zorném poli, aby se porovnaly podobnosti a rozdíly mezi těmito dvěma objekty.
Tradiční optické mikroskopy se skládají převážně z optických systémů a jejich podpůrných mechanických struktur. Optické systémy zahrnují čočky objektivů, okuláry a kondenzorové čočky, což jsou všechno složité lupy vyrobené z různých optických skel. Čočka objektivu zvětšuje preparát a jeho zvětšení Mobject je určeno následujícím vzorcem: Mobject =Δ∕f'object, kde f'object je ohnisková vzdálenost čočky objektivu a Δmůže být chápáno jako vzdálenost mezi čočkou objektivu a okulárem. Okulár znovu zvětšuje obraz vytvořený čočkou objektivu a vytváří virtuální obraz ve vzdálenosti 250 mm před lidským okem pro pozorování. Toto je nejpohodlnější pozorovací pozice pro většinu lidí. Zvětšení okuláru M=250/f' oko, kde f' je ohnisková vzdálenost okuláru. Celkové zvětšení mikroskopu je součinem čočky objektivu a okuláru, tedy M=M objekt*M oko=Δ*250/f' oko *f; objekt. Je vidět, že zmenšením ohniskové vzdálenosti objektivu a okuláru se zvýší celkové zvětšení, které je klíčem k vidění bakterií a jiných mikroorganismů mikroskopem a je to také rozdíl mezi ním a běžnými lupami.
Je tedy možné bez omezení zmenšit síť f' objektu f', aby se zvětšilo zvětšení, abychom mohli vidět jemnější objekty? Odpověď je ne! Je to proto, že světlo používané pro zobrazování je v podstatě druh elektromagnetické vlny, takže během procesu šíření nevyhnutelně dojde k difrakčním a interferenčním jevům, stejně jako vlnění na vodní hladině, které lze vidět v každodenním životě, když narazíte na překážky. a dva sloupce vodních vln se mohou navzájem zesílit nebo zeslabit, když se setkají. Když světelná vlna vyzařovaná ze světelného objektu bodového tvaru vstoupí do čočky objektivu, rám čočky objektivu brání šíření světla, což má za následek difrakci a interferenci. Po průchodu čočkou objektivu se již nemůže shromažďovat v jednom bodě, ale tvoří světelnou skvrnu o určité velikosti a na periferii je řada světelných prstenců se slabou a postupně slábnoucí intenzitou. Centrální světlý bod nazýváme Airy disk. Když jsou dva body vyzařující světlo blízko určité vzdálenosti, budou se tyto dva světelné body překrývat, dokud je nelze rozpoznat jako dva světelné body. Rayleigh navrhl úsudkový standard a myslel si, že když je vzdálenost mezi středy dvou světelných bodů rovna poloměru Airyho disku, lze tyto dvě světelné skvrny rozlišit. Po výpočtu je vzdálenost mezi dvěma body vyzařujícími světlo v tomto okamžiku e=0.61 In/n.sinA=0.61 In/NA Ve vzorci In je vlnová délka světla, a vlnová délka světla, kterou může lidské oko přijmout, je asi 0.4-0.7um an je index lomu prostředí, kde se nachází bod vyzařování světla. Například ve vzduchu je n≈1, ve vodě n≈1,33 a A je polovina úhlu otevření luminiscenčního bodu k rámu čočky objektivu a NA se nazývá numerická apertura čočky objektivu. Z výše uvedeného vzorce je vidět, že vzdálenost mezi dvěma body, které může čočka objektivu rozlišit, je omezena vlnovou délkou světla a numerickou aperturou. Protože vlnová délka nejcitlivějšího lidského oka je asi 0,5 um a úhel A nemůže překročit 90 stupňů, je sinA vždy menší než 1. Maximální index lomu dostupné propustnosti světla medium je asi 1,5, takže hodnota e je vždy větší než 0.2um, což je minimální limitní vzdálenost, kterou lze rozlišit optickým mikroskopem. Zvětšete obrázek pomocí mikroskopu. Pokud chcete zvětšit vzdálenost bodu objektu e, kterou lze rozlišit čočkou objektivu s určitou hodnotou NA, která je dostatečná na to, aby ji dokázalo rozdělit lidské oko, potřebujete Me Větší než nebo rovno 0.15 mm, kde { {29}}.15mm je minimální vzdálenost mezi dvěma mikroobjekty, které lze rozlišit lidským okem ve vzdálenosti 250mm před vašima očima, takže M Větší nebo rovno (0,15∕0,61)NA ≈500 N.A. Stačí dvojnásobné zvětšení, tedy 500N.A Menší nebo rovno M Menší nebo rovno 1000N.A, což je rozumný výběrový rozsah celkového zvětšení mikroskopu. Bez ohledu na to, jak velké je celkové zvětšení, je to nesmyslné, protože numerická apertura čočky objektivu omezila minimální rozlišitelnou vzdálenost a nelze rozlišit menší detaily objektu zvýšením zvětšení.
Zobrazovací kontrast je dalším klíčovým problémem optických mikroskopů. Takzvaný kontrast označuje černobílý kontrast nebo barevný rozdíl mezi sousedními částmi na povrchu obrazu. Pro lidské oko je obtížné posoudit rozdíl jasu pod 0.02, ale je o něco citlivější na rozdíl barev. Některé objekty mikroskopu, jako jsou biologické vzorky, mají velmi malý rozdíl v jasu mezi detaily a chyby návrhu a výroby optického systému mikroskopu dále snižují kontrast zobrazení a znesnadňují rozlišení. V tuto chvíli nelze jasně vidět detaily objektu.
V průběhu let lidé tvrdě pracovali na zlepšení rozlišení a zobrazovacího kontrastu mikroskopu. S neustálým rozvojem výpočetní techniky a nástrojů se také neustále zdokonalovala teorie a metody optického designu. Ve spojení se zlepšováním výkonnosti surovin, neustálým zlepšováním technologií a metod detekce a inovací metod pozorování se kvalita zobrazení optického mikroskopu přiblížila dokonalosti difrakčního limitu. Lidé budou používat barvení vzorků, tmavé pole, fázový kontrast, fluorescenci, interferenci a polarizované světlo. Zobrazovací přístroje vycházejí jeden za druhým a mají v některých ohledech vynikající výkon, ale stále nemohou konkurovat optickým mikroskopům z hlediska levnosti, pohodlí, intuice a zvláště vhodné pro výzkum živých organismů. Optické mikroskopy stále pevně zaujímají své vlastní pozice. Na druhé straně v kombinaci s laserem, počítačem, novými materiálovými technologiemi a informačními technologiemi starý optický mikroskop omlazuje a ukazuje energickou vitalitu. Digitální mikroskopy, laserové konfokální rastrovací mikroskopy, rastrovací mikroskopy blízkého pole, dvoufotonové mikroskopy a přístroje s různými novými funkcemi nebo se dokážou přizpůsobit různým novým podmínkám prostředí se objevují v nekonečném proudu, což dále rozšiřuje aplikační pole optických mikroskopů, jako např. příklady. Jak vzrušující jsou mikroskopické snímky skalních útvarů nahrané z Mars roverů! Můžeme plně věřit, že optický mikroskop prospěje lidstvu s aktualizovaným přístupem.
