Úvod do fluorescenční mikroskopie
Fluorescenční mikroskopie spočívá v ozařování předmětu obarveného fluoresceinem světlem s krátkou vlnovou délkou, takže je excitován za vzniku fluorescence na dlouhé vlnové délce a poté je pozorován. Ve fluorescenčním mikroskopu musí být excitační světlo specifické vlnové délky vybráno z osvětlovacího světla vzorku, aby se vytvořila fluorescence, a poté musí být fluorescence oddělena od smíšeného světla excitačního světla a fluorescence pro pozorování. Proto hraje filtrační systém mimořádně důležitou roli při výběru konkrétní vlnové délky. Fluorescenční mikroskopy jsou široce používány v biologii, medicíně a dalších oborech.
1. Hlavní součásti fluorescenčního mikroskopu:
(A) Světelný zdroj: Světelný zdroj vyzařuje světlo různých vlnových délek (od ultrafialového po infračervené). a
(B) Světelný zdroj s excitačním filtrem: prostřednictvím světla specifické vlnové délky, které může způsobit, že vzorek produkuje fluorescenci, a zároveň blokuje světlo, které je pro excitaci fluorescence nepoužitelné. a
(C) Fluorescenční vzorky: obecně obarvené fluorescenčními pigmenty. a
(D) Blokovací filtr: blokuje excitační světlo, které není absorbováno vzorkem, a selektivně propouští fluorescenci a některé vlnové délky jsou selektivně prostupovány fluorescencí.
a
2. Klasifikace fluorescenčních mikroskopů:
Fluorescenční mikroskopy se obecně dělí na dva typy: transmisní a epiemisní:
A. Typ přenosu: excitační světlo vychází ze spodní části objektu, který má být kontrolován, a kondenzor je kondenzor v tmavém poli, takže excitační světlo nevstupuje do čočky objektivu, ale fluorescence vstupuje do čočky objektivu. Při malém zvětšení je jasný, při velkém zvětšení tmavý. Je obtížné pracovat v olejovém ponoření a centrování. Je obzvláště obtížné určit rozsah osvětlení při malých zvětšeních, ale může to mít velmi tmavé pozadí zorného pole. Typ přenosu se nepoužívá pro neprůhledné objekty. a
b. Epi-type: Typ přenosu je v současnosti téměř vyloučen. Většina nových fluorescenčních mikroskopů je typu epi. Světelný zdroj přichází shora nad kontrolovaným objektem a v optické dráze je rozdělovač paprsků, takže je vhodný pro kontrolované průhledné i neprůhledné objekty. Vzhledem k tomu, že čočka objektivu funguje jako kondenzorová čočka, je nejen snadné ji ovládat, ale také lze dosáhnout rovnoměrného osvětlení celého zorného pole od malého zvětšení až po velké zvětšení. a
a
3. Bezpečnostní opatření pro fluoroskopii
A. Dlouhodobé ozařování excitačního světla způsobí útlum a zhášení fluorescence, proto co nejvíce zkraťte dobu pozorování a při dočasném nepozorování použijte přepážku k zakrytí excitačního světla. a
b. Při pozorování olejovou imerzní čočkou používejte „nefluorescenční olej“. a
C. Fluorescence je téměř vždy slabá a měla by být prováděna v tmavé místnosti. a
d. Nejlepší je nainstalovat stabilizátor napětí do napájecího zdroje, jinak nestabilní napětí nejen sníží životnost rtuťové výbojky, ale také ovlivní účinek kontroly mikroskopem. a
a
4. Použití fluorescenční mikroskopie
1. Požadavky na přípravu vzorků fluorescenčního mikroskopu
A. Skleněné sklíčko
Tloušťka podložního skla by měla být mezi 0,8 a 1,2 mm. Příliš silné sklíčko jednak pohltí více světla a jednak se excitační světlo nemůže soustředit na preparát. Sklíčka musí být hladká, stejnoměrná v tloušťce a bez zjevné autofluorescence. Někdy se používají sklíčka z křemenného skla. a
b. Krycí sklo
Tloušťka krycího skla je asi 0,17 mm, hladké. Pro posílení excitačního světla lze použít i suché krycí sklo, což je speciální krycí sklo potažené několika vrstvami látek (např. fluorid hořečnatý), které mají různé interferenční účinky na světlo různých vlnových délek, což může způsobit fluorescence probíhá hladce. Excitační světlo prochází skrz a odražené excitační světlo excituje vzorek. a
C. Vzorek
Plátky tkáně nebo jiné vzorky by neměly být příliš silné. Pokud je příliš silný, většina excitačního světla se spotřebuje ve spodní části preparátu, zatímco horní část přímo pozorovaná čočkou objektivu nemůže být plně vybuzena. Kromě toho se buňky překrývají nebo nečistoty zakrývají, což ovlivňuje posouzení. a
d. Montážní prostředek
Glycerin se běžně používá jako montážní činidlo, které nesmí mít žádnou autofluorescenci, je bezbarvé a průhledné a jas fluorescence je jasnější při pH 8.5-9.5 a není snadné rychle vyblednout. Proto se jako montážní činidlo běžně používá stejná směs glycerolu a 0,5mol/l roztoku uhličitanového pufru s pH 9.{6}} až 9,5. a
E. zrcadlový olej
Obecně se imerzní olej musí používat při pozorování vzorků pomocí fluorescenčních mikroskopů s tmavým polem a imerzních objektivů s olejovou imerzí. Nejlepší je použít speciální nefluorescenční zrcadlový olej, který lze nahradit i výše zmíněným glycerinem, lze použít i tekutý parafín, ale index lomu je nízký, což mírně ovlivňuje kvalitu obrazu.
