Jak se fluorescenční mikroskopie liší od konvenční mikroskopie
Nedávno jsem se pokusil udělat nějaké zmrazené řezy myší a nyní musím použít fluorescenční mikroskop, abych zjistil, zda se virus, který jsem injikoval, nachází v požadované oblasti mozku. Některé základní principy fluorescenční mikroskopie je třeba stručně prostudovat a také se o ně zde podělím.
Fluorescenční mikroskop používá ultrafialové světlo jako zdroj světla k osvětlení testovaného objektu, což způsobí, že objekt emituje zdroj světla a poté objekt pozoruje pod mikroskopem. Používá se hlavně pro imunofluorescenční buňky a skládá se ze zdroje světla, systému filtračních desek a optického systému pro pozorování fluorescenčního obrazu vzorku prostřednictvím zvětšení okuláru a čočky objektivu. Pojďme se podívat na rozdíl mezi tímto fluorescenčním mikroskopem a běžným optickým mikroskopem.
1. Z hlediska způsobů osvětlení
Metoda osvětlení fluorescenčního mikroskopu obecně používá metodu padajícího paprsku, což znamená, že zdroj světla je promítán na testovaný vzorek přes čočku objektivu.
2. Z hlediska rozlišení
Fluorescenční mikroskopie využívá jako zdroj světla ultrafialové světlo s relativně krátkou vlnovou délkou, ale vyšším rozlišením než běžné optické mikroskopy.
3. Rozdíly na filtru
Fluorescenční mikroskop používá dva speciální filtry, jeden před světelným zdrojem k odfiltrování viditelného světla a druhý mezi objektivem a okulárem k odfiltrování ultrafialového světla, které může chránit oči.
Fluorescenční mikroskopie je také typem optického mikroskopu, především proto, že vlnová délka excitovaná fluorescenční mikroskopií je krátká, což vede k rozdílům ve struktuře a použití fluorescenční mikroskopie a běžné mikroskopie. Většina fluorescenčních mikroskopů má dobrou funkci zachycení slabého světla, takže jejich zobrazovací schopnost je dobrá i při extrémně slabé fluorescenci. Navíc s neustálým zdokonalováním fluorescenční mikroskopie v posledních letech se výrazně snížil i šum. Proto se stále více uplatňuje fluorescenční mikroskopy.
Znalosti týkající se dvoufotonové fluorescenční mikroskopie
Základní princip dvoufotonové excitace spočívá v tom, že při vysoké hustotě fotonů mohou fluorescenční molekuly současně absorbovat dva fotony s dlouhou vlnovou délkou a po krátké době života v tzv. excitovaném stavu emitovat foton s kratší vlnovou délkou; Jeho účinek je stejný jako při použití fotonu s vlnovou délkou poloviny dlouhé vlnové délky k excitaci fluorescenčních molekul. Dvoufotonová excitace vyžaduje vysokou hustotu fotonů, a aby nedošlo k poškození buněk, používá se ve dvoufotonovém mikroskopu vysokoenergetický pulzní laser s uzamčeným režimem. Laser vyzařovaný tímto typem laseru má vysokou špičkovou energii a nízkou průměrnou energii, s šířkou pulsu pouze 100 femtosekund a frekvencí až 80 až 100 megahertzů. Při použití objektivu s vysokou numerickou aperturou k zaostření fotonů pulzního laseru je hustota fotonů v ohnisku objektivu nejvyšší a k dvoufotonové excitaci dochází pouze v ohnisku objektivu. Dvoufotonový mikroskop tedy nevyžaduje konfokální dírky, což zlepšuje účinnost fluorescenční detekce.
V obecných fluorescenčních jevech může fluorescenční molekula v důsledku nízké fotonové hustoty excitace absorbovat pouze jeden foton ve stejnou dobu a poté emitovat jeden fluorescenční foton prostřednictvím radiačního přechodu, který se nazývá fluorescence jednoho fotonu. Pro fluorescenční excitační proces využívající laser jako zdroj světla může docházet k dvoufotonovému nebo dokonce vícefotonovému fluorescenčnímu jevu. V tomto okamžiku má použitý zdroj excitačního světla vysokou intenzitu a hustota fotonů splňuje požadavek, aby fluorescenční molekuly absorbovaly dva fotony současně. V procesu použití typického laseru jako zdroje excitačního světla hustota fotonů stále není dostatečná pro vytvoření fenoménu dvoufotonové absorpce. Typicky se používají femtosekundové pulzní lasery a jejich okamžitý výkon může dosáhnout úrovně megawattů. Proto je vlnová délka dvoufotonové fluorescence kratší než vlnová délka excitace, což je ekvivalentní efektu vyvolanému excitací poloviční excitační vlnovou délkou.
