Jak si můžete vybrat ten správný konfokální mikroskop pro vás? Existuje nějaká konkrétní metoda?
Konfokální mikroskopie má více výhod než širokoúhlá mikroskopie. Konfokální mikroskopie může provádět kontinuální optické řezy vzorků a vyloučit interferenci signálu z neohniskových rovin. Z tohoto důvodu je aplikace konfokální mikroskopie skutečně běžnější. Na trhu je však stále více konfokálních mikroskopů. Jak si vybrat?
Konfokální mikroskopie má více výhod než širokoúhlá mikroskopie. Konfokální mikroskopie může vytvářet souvislé optické řezy vzorků a vyloučit interferenci signálu z neohniskových rovin. Z tohoto důvodu je konfokální mikroskopie skutečně běžnější. Na trhu je však stále více konfokálních mikroskopů. Jak si vybrat? Při výběru konfokálního mikroskopu jsou dvě základní a důležitá hlediska: typ vzorku, který chcete studovat (např. fixní nebo živé buňky), a typ testu, který chcete provést (např. statické nebo dynamické buněčné procesy).
Konfokální zobrazování fixních buněk
K zobrazení fixovaných a obarvených buněk nebo tkání obecně volíme konfokální laserové skenování (LSCM). Je to hlavně proto, že fixované mrtvé buňky postrádají rychlé biologické děje v živých buňkách a mohou lépe těžit z vyššího prostorového rozlišení LSCM. Zobrazování LSCM spočívá v optickém řezání vzorku laserem a rychlost skenování (v závislosti na rychlosti zrcadla skenovacího pole) je obecně 1 obr./s. Delší expoziční časy znamenají větší riziko fotobělení, ale pro fixované odumřelé buňky není čas rozhodující a můžeme jej zprůměrovat pořízením více snímků.
Konfokální zobrazování živých buněk
Zobrazování živých buněk vyžaduje dodatečnou ochranu před nepříznivým prostředím. Při zobrazování je naším prvním hlediskem zachování životaschopnosti a zdraví buněk. Topná tělesa s konstantní teplotou a perfuzní systémy jsou nezbytné, zejména pro časosběrné studie. Rychlé biochemické děje, které řídí fyziologický stav živých buněk, jsou to, co chce většina lidí studovat, ale tyto děje jsou pro konvenční LSCM příliš rychlé. Navíc prodloužená expozice LSCM také vyvolala toxické poškození buněk světlem. Proto zobrazování živých buněk vyžaduje speciální konfokální mikroskopy.
Obecně existují dvě možnosti pro konfokální zobrazování živých buněk: rychlé skenovací laserové skenovací konfokální jednotky a konfokální disky s rotujícím diskem. Rychlá skenovací konfokální mikroskopie nahrazuje pomalejší galvanometrická zrcadla rychlejšími rezonančními skenovacími zrcadly, která umožňuje skenování rychlostí až 30 snímků za sekundu; zatímco konfokální disky s rotujícím diskem (SDCM) mají výhodu rychlejšího skenování (i když nevyhnutelně se ztrátou prostorového rozlišení), jeho rychlost může teoreticky dosáhnout 2000 snímků za sekundu (v praxi je často limitována jinými faktory).
Pokud máte obavy z fotobělení nebo velmi slabého fluorescenčního signálu, pak může být vhodnější SDCM. SDCM používá dva rotující disky s uspořádanými mikrojamkami k rozptýlení excitačního světla. Na rozdíl od LSCM, který skenuje místo vzorku, SDCM získává více bodů najednou (asi 100 pixelů), takže se výrazně zvýší rychlost a fotobělení SDCM a menší fototoxicita. Můžete však také použít rychlé skenovací konfokály pro zvýšení rychlosti skenování v kombinaci s vysoce citlivými detektory a snížení excitační světelné energie pro snížení fototoxicity, což může zachovat bohaté funkce tradičních konfokálů.
Automatizovaný konfokální zobrazovací systém
Někteří výzkumníci rádi hledají způsoby, jak upravit mikroskop tak, aby vyhovoval jejich individuálním potřebám. A některé výzkumníky ani nezajímá, jak vlastně mikroskopy fungují. Těm druhým může být více po chuti automatický konfokální mikroskop. Například Olympus FluoViewFV10i je takový plně automatický stolní 4-laserový konfokální mikroskop. Jeho kompaktní integrovaná konstrukce nevyžaduje téměř žádný instalační prostor. Tento typ přístroje je ideální pro výzkumníky, kteří potřebují každý den pořizovat velké množství obrazových dat, ale samozřejmě plně neodrážejí funkčnost a flexibilitu tradičních konfokálů. Kromě toho je NikonA1 také plně automatickým konfokálním systémem. Stejně jako většina běžných konfokálních skenovacích mikroskopů používá NikonA1 skenovací hlavu galvanometru, která má vyšší rozlišení než A1R s hybridní skenovací hlavou, ale o něco nižší rychlost (A1R ~30fps)
