Znalosti související s fluorescenčním mikroskopem
Základní princip konfokální fluorescenční mikroskopie: k ozáření preparátu se používá bodový světelný zdroj a na ohniskové rovině se vytvoří dobře definovaná malá světelná skvrna. složený ze štípaček. Dělič paprsku posílá fluorescenci přímo do detektoru. Před zdrojem světla a detektorem je dírka, která se nazývá dírka osvětlení a dírka detekce. Geometrická velikost obou je stejná, asi 100-200nm; vzhledem ke světelné skvrně na ohniskové rovině jsou tyto dvě konjugované, to znamená, že světelná skvrna prochází řadou čoček a nakonec může být zaostřena na osvětlovací dírku a detekční dírku současně. Tímto způsobem se světlo z ohniskové roviny může sbíhat v rámci detekčního otvoru, zatímco rozptýlené světlo nad nebo pod ohniskovou rovinou je blokováno mimo detekční otvor a nelze jej zobrazit. Laser skenuje vzorek bod po bodu a trubice fotonásobiče po detekci dírky také získá konfokální obraz odpovídajícího světelného bodu bod po bodu, který je převeden na digitální signál a přenesen do počítače a nakonec agregován do čistého konfokální obraz celé ohniskové roviny na obrazovce.
Každý snímek ohniskové roviny je ve skutečnosti optickým řezem preparátem a tento optický řez má vždy určitou tloušťku, také známou jako optický tenký řez. Protože intenzita světla v ohnisku je mnohem větší než v nezaostřeném bodě a světlo v neohniskové rovině je filtrováno dírkou, je hloubka pole konfokálního systému přibližně nulová a skenování podél Z -axis může realizovat optickou tomografii, tvořící pozorování dvourozměrného optického řezu na zaostřeném místě vzorku. Kombinací skenování v rovině XY (ohnisková rovina) se skenováním v ose Z (optická osa) lze získat trojrozměrný obraz vzorku akumulací dvourozměrných obrazů spojitých vrstev a zpracovat speciálním počítačovým softwarem.
To znamená, že detekční dírka a dírka světelného zdroje jsou vždy zaostřeny na stejný bod, takže fluorescence excitovaná mimo ohniskovou rovinu nemůže vstoupit do detekční dírky.
Jednoduchým vyjádřením pracovního principu laserového konfokálu je, že jako zdroj světla používá laserové světlo. Na základě klasického zobrazování pomocí fluorescenčního mikroskopu přidává laserové skenovací zařízení a konjugované zaostřovací zařízení a jedná se o systém pro digitální pořizování a zpracování obrazu pomocí počítačového řízení.
