Rozdíly a vlastnosti mezi fluorescenčním mikroskopem a běžným optickým mikroskopem
Fluorescenční mikroskop se liší od běžného optického mikroskopu. Nepozoruje vzorek prostřednictvím osvětlení běžného světelného zdroje. Místo toho používá světlo o určité vlnové délce (obvykle ultrafialové světlo, modrofialové světlo) k excitaci fluorescenčního materiálu ve vzorku pod mikroskopem, což způsobí, že emituje fluorescenci. Světelný zdroj fluorescenčního mikroskopu tedy neslouží jako přímé osvětlení, ale jako zdroj energie, který excituje vnitřní fluorescenční materiál vzorku. Důvod, proč můžeme pozorovat vzorek, není způsoben osvětlením světelného zdroje, ale fluorescenčním jevem způsobeným fluorescenčním materiálem ve vzorku absorbujícím excitovanou světelnou energii. Je vidět, že hlavní charakteristikou fluorescenčního mikroskopu je, že jeho světelný zdroj může dodávat velké množství excitačního světla v určitém rozsahu vlnových délek, takže fluorescenční látky ve zkoumaném vzorku mohou získat potřebnou intenzitu excitačního světla. Zároveň musí mít fluorescenční mikroskopy odpovídající filtrační systémy. Fluorescenční mikroskopie je základním nástrojem pro pokročilou fluorescenční histochemii. Skládá se z ultravysokotlakého zdroje světla, filtračního systému (včetně excitačních a potlačovacích filtračních desek), optického systému a fotografického systému. Využívá světlo určité vlnové délky k excitaci vzorku, aby emitoval fluorescenci.
1. Způsoby excitace fluorescence: Podle rozsahu vlnových délek světla se dělí na dva typy: UV excitační metoda (pomocí metody ultrafialového osvětlení) a BV excitační metoda (pomocí modrofialového světla). Metoda UV excitace využívá k buzení blízké ultrafialové světlo kratší než 400 nm. V této metodě není žádné viditelné excitační světlo, takže pozorovaná fluorescence ukazuje inherentní fluorescenci barviva, takže je snadné odlišit specifickou fluorescenci na vzorku od autofluorescence tkáně pozadí.
2. BV excitační metoda: excitace z ultrafialového na modré světlo se středem na 404nm a 434nm. Tato metoda využívá k osvětlení preparátu modré světlo, takže cut-off filtr fluorescenčního pozorovacího systému musí používat filtr, který dokáže zcela blokovat modré světlo a plně propustit požadovanou zelenou a žlutou fluorescenci. Fluorescenční barviva používaná ve fluorescenčních protilátkových metodách. Maximální vlnová délka absorpce excitačního světla a maximální emisní vlnová délka fluorescence jsou relativně blízko, takže filtr použitý v BV excitační metodě musí používat ostrý cutoff filtr. Tato metoda může využívat modré světlo jako excitační světlo, takže absorpční účinnost fluorescenčních pigmentů je vyšší a lze získat jasnější snímky. Nevýhodou je, že fluorescence pod 500nm není vidět, zatímco fluorescence nad 500nm způsobuje, že celý obraz vypadá žlutě. U metody fluorescenčních protilátek se specifičnost fluorescenčního barviva většinou posuzuje podle jeho jedinečné barvy. Proto při diskuzi o jemné specifičnosti mají často velký dopad výše uvedené nedostatky BV excitační metody.
