Rozdíly a výhody a nevýhody mezi transmisní fluorescenční mikroskopií a reflexní fluorescenční mikroskopií
1. Transmisní fluorescenční mikroskop: Zdroj excitačního světla prochází skrz materiál vzorku přes kondenzátor, aby excitoval fluorescenci. Běžně používané koncentrátory tmavého pole nebo obyčejné koncentrátory lze použít k nastavení reflektoru pro převod excitačního světla a bočního světla na vzorek. Jedná se o poměrně staromódní fluorescenční mikroskop. Jeho výhodou je silná fluorescence při malém zvětšení, naopak nevýhodou, že jeho fluorescence s rostoucím zvětšením slábne. Proto je lepší pro pozorování větších vzorků materiálů.
2. Fluorescenční mikroskop s dopadajícím paprskem: Jedná se o nový typ fluorescenčního mikroskopu, který se vyvinul v moderní době. Na rozdíl od předchozího dopadá excitační světlo z čočky objektivu na povrch preparátu za použití stejné čočky objektivu jako osvětlovací kondenzor a čočka objektivu pro sběr fluorescence. K optické dráze je třeba přidat dvoubarevný oddělovač paprsků, který s fotouranem svírá úhel 45 stupňů. Budící světlo se odráží do čočky objektivu a shromažďuje se na vzorku. Fluorescence generovaná vzorkem a excitační světlo odražené od povrchu čočky objektivu a krycího skla současně vstupují do čočky objektivu a vracejí se do dvoubarevného separátoru paprsků, kde se odděluje excitační světlo a fluorescence. Zbytkové excitační světlo je pak absorbováno blokovacím filtrem. Pokud se použijí různé kombinace excitačních filtrů, dvoubarevných separátorů paprsků a blokovacích filtrů, mohou splnit potřeby různých produktů fluorescenční reakce. Výhodou tohoto fluorescenčního mikroskopu je rovnoměrné osvětlení zorného pole, jasné zobrazení a silnější fluorescence s vyšším zvětšením.
Výhody a nevýhody transmisní fluorescenční mikroskopie
Světelný zdroj: Vysokotlaká rtuťová výbojka nebo halogenová výbojka.
Zrcadlo bodového světla: Použití bodového světla tmavého pole k oddělení excitace a fluorescence.
Objektiv: Lze použít jakýkoli typ objektivu.
Vzorek: Pro transmisní pozorování jsou vhodnější tenké vzorky.
Výhody: ① Díky použití kondenzoru tmavého pole nemůže excitační světlo vstupovat do čočky objektivu, takže je snadné vytvořit tmavé pozadí a dosáhnout dobrého kontrastu a pro pozorování lze použít jakoukoli čočku objektivu. ② Při použití objektivu s malým zvětšením je jasnější než reflexní fluorescenční mikroskop.
Nevýhoda: Střed a výška reflektoru musí být správně nastaveny, jinak nelze získat jasný fluorescenční obraz. Kvůli omezení ohniskové vzdálenosti bodového světla v tmavém poli nelze použít silné skleněné diapozitivy. Osvětlená plocha zorného pole by neměla být příliš velká, jinak by mohlo dojít k vyblednutí fluorescenční barvy fluorescenčního preparátu. Tlusté nebo neprůhledné vzorky nejsou vhodné.
Výhody a nevýhody reflexní fluorescenční mikroskopie
Světelný zdroj: Vysokotlaká rtuťová výbojka nebo halogenová výbojka.
Zaostřovací čočka: Jelikož čočka objektivu slouží jako zaostřovací čočka, není potřeba zaostřovací čočka.
Čočka objektivu: Použitá čočka objektivu musí být schopna propouštět dostatečné množství ultrafialového světla a nesmí sama produkovat fluorescenci, bez omezení numerické apertury.
Vzorek: Lze pozorovat silné i neprůhledné vzorky.
Výhody: ① Protože čočka objektivu slouží také jako reflektor, nevyžaduje mnoho úprav. ② Použitím metody osvětlení Kolar lze využít účinky clony a apertur zorného pole Numerická apertura objektivu není omezena a snímky s vysokým rozlišením lze získat také při velkém zvětšení Silné nebo neprůhledné vzorky lze pozorovat a lze použít i tlustá krycí sklíčka S odraženou fluorescencí lze také kombinovat jiné pozorovací metody, zejména s metodou fázového rozdílu a metodou transmisní diferenciální interference Může se vyhnout zbytečnému jevu blednutí barvy fluorescence.
Nevýhoda: Při použití objektivu se zemním zvětšením je obraz poměrně tmavý, proto je nutné použít objektiv s vysokou numerickou aperturou. Filtrační systém musí účinně oddělit excitační luminiscenci a fluorescenci.,
