Rozdíl mezi běžným mikroskopem a fluorescenčním mikroskopem
Fluorescenční mikroskopy používají ultrafialové světlo jako zdroj světla k ozařování kontrolovaného objektu, takže objekt vyzařuje světlo, a poté objekt pozoruje pod mikroskopem. Používá se hlavně pro imunofluorescenční buňky. Skládá se hlavně ze zdroje světla, systému filtračních desek a optického systému pro pozorování fluorescenčního obrazu vzorku prostřednictvím zvětšení okuláru a čočky objektivu. Pojďme se podívat na rozdíl mezi tímto fluorescenčním mikroskopem a běžným optickým mikroskopem.
1. Z hlediska způsobů osvětlení
Způsob osvětlení fluorescenčního mikroskopu je obecně episkopický, to znamená, že zdroj světla je promítán na testovaný vzorek přes čočku objektivu.
2. Z hlediska rozlišení
Fluorescenční mikroskopy využívají jako zdroj světla ultrafialové světlo. Vlnová délka je relativně krátká, ale rozlišení je vyšší než u běžných optických mikroskopů.
3. Rozdíl ve filtru
Fluorescenční mikroskop používá dva speciální filtry, které se používají před zdrojem světla k odfiltrování viditelného světla a mezi čočkou objektivu a okulárem k odfiltrování ultrafialového světla, které může chránit lidské oči.
Fluorescenční mikroskop je také druh optického mikroskopu, hlavně proto, že vlnová délka excitovaná fluorescenčním mikroskopem je krátká, takže to vede k rozdílu ve struktuře a použití mezi fluorescenčním mikroskopem a běžným mikroskopem. Většina fluorescenčních mikroskopů má dobrou funkci pro zachycení slabého světla, takže při extrémně slabé fluorescenci je jeho zobrazovací schopnost také dobrá. Ve spojení s neustálým zlepšováním fluorescenčních mikroskopů v posledních letech se také výrazně snížil šum. Proto se používá stále více fluorescenčních mikroskopů.
Znalosti o dvoufotonové fluorescenční mikroskopii
Základní princip dvoufotonové excitace je: v případě vysoké hustoty fotonů mohou fluorescenční molekuly absorbovat dva dlouhovlnné fotony současně a po krátké době života tzv. excitovaného stavu emitovat foton kratší vlnové délky. . ; účinek je stejný jako při použití fotonu, jehož vlnová délka je poloviční než dlouhá vlnová délka k excitaci fluorescenční molekuly. Dvoufotonová excitace vyžaduje vysokou hustotu fotonů. Aby nedošlo k poškození buněk, používá dvoufotonová mikroskopie vysokoenergetické pulzní lasery s uzamčeným režimem. Laser emitovaný tímto laserem má vysokou špičkovou energii a nízkou průměrnou energii, jeho šířka pulzu je pouze 100 femtosekund a jeho frekvence může dosahovat 80 až 100 megahertzů. Při použití čočky objektivu s vysokou numerickou aperturou k zaostření fotonů pulzního laseru je hustota fotonů v ohnisku čočky objektivu nejvyšší a k buzení dvěma fotony dochází pouze v ohnisku čočky objektivu, takže dvoufotonový mikroskop nepotřebuje konfokální dírku, což zlepšuje účinnost fluorescenční detekce.
V obecných fluorescenčních jevech může fluorescenční molekula v důsledku nízké hustoty fotonů excitačního světla absorbovat pouze jeden foton ve stejnou dobu a poté emitovat fluorescenční foton prostřednictvím radiačního přechodu, což je jednofotonová fluorescence. Pro fluorescenční excitační proces využívající laser jako zdroj světla může nastat dvoufotonová nebo dokonce vícefotonová fluorescence. V této době je intenzita použitého zdroje excitačního světla vysoká a hustota fotonů odpovídá požadavkům fluorescenčních molekul absorbujících dva fotony současně. V procesu použití obecného laseru jako zdroje excitačního světla hustota fotonů stále nestačí k vytvoření fenoménu dvoufotonové absorpce. Obvykle se používá femtosekundový pulzní laser a jeho okamžitý výkon může dosahovat řádu megawattů. Proto je vlnová délka dvoufotonové fluorescence kratší než vlnová délka excitačního světla, což je ekvivalentní efektu vyvolanému excitací při poloviční vlnové délce excitace.
Dvoufotonová fluorescenční mikroskopie má mnoho výhod:
1) Dlouhovlnné světlo je méně ovlivněno rozptylem než světlo krátkovlnné a snadno proniká vzorkem;
2) Fluorescenční molekuly mimo ohniskovou rovinu nejsou excitovány, takže více excitačního světla může dosáhnout ohniskové roviny, takže excitační světlo může proniknout hlouběji do vzorků;
3) Dlouhovlnné blízké infračervené světlo je pro buňky méně toxické než světlo krátkovlnné;
4) Při použití dvoufotonového mikroskopu k pozorování preparátů dochází k fotobělení a fototoxicitě pouze v ohniskové rovině. Proto je dvoufotonová mikroskopie vhodnější než jednofotonová pro pozorování silných preparátů, pro pozorování živých buněk nebo pro experimenty bodového fotobělení.
Znalosti o konfokální fluorescenční mikroskopii
Základní princip konfokální fluorescenční mikroskopie: k ozáření preparátu se používá bodový světelný zdroj a na ohniskové rovině se vytvoří dobře definovaná malá světelná skvrna. složený ze štípaček. Dělič paprsku posílá fluorescenci přímo do detektoru. Před zdrojem světla a detektorem je dírka, která se nazývá dírka osvětlení a dírka detekce. Geometrická velikost obou je stejná, asi 100-200nm; vzhledem ke světelné skvrně na ohniskové rovině jsou tyto dvě konjugované, to znamená, že světelná skvrna prochází řadou čoček a nakonec může být zaostřena na osvětlovací dírku a detekční dírku současně. Tímto způsobem se světlo z ohniskové roviny může sbíhat v rámci detekčního otvoru, zatímco rozptýlené světlo nad nebo pod ohniskovou rovinou je blokováno mimo detekční otvor a nelze jej zobrazit. Laser skenuje vzorek bod po bodu a trubice fotonásobiče po detekci dírky také získá konfokální obraz odpovídajícího světelného bodu bod po bodu, který je převeden na digitální signál a přenesen do počítače a nakonec agregován do čistého konfokální obraz celé ohniskové roviny na obrazovce.
Každý snímek ohniskové roviny je ve skutečnosti optickým řezem preparátem. Tento optický průřez má vždy určitou tloušťku, také známou jako optický tenký průřez. Protože intenzita světla v ohnisku je mnohem větší než v nezaostřeném bodě a světlo v neohniskové rovině je filtrováno dírkou, hloubka pole konfokálního systému je přibližně nulová a skenování podél Z -axis může realizovat optickou tomografii, tvořící pozorování dvourozměrného optického řezu na zaostřeném místě vzorku. Kombinací skenování v rovině XY (ohnisková rovina) se skenováním v ose Z (optická osa) lze získat trojrozměrný obraz vzorku akumulací dvourozměrných obrazů spojitých vrstev a zpracovat speciálním počítačovým softwarem.
To znamená, že detekční dírka a dírka světelného zdroje jsou vždy zaostřeny na stejný bod, takže fluorescence excitovaná mimo ohniskovou rovinu nemůže vstoupit do detekční dírky.
Jednoduchým vyjádřením pracovního principu laserového konfokálu je, že jako zdroj světla využívá laser a na základě tradičního zobrazování pomocí fluorescenčního mikroskopu přidává laserové skenovací zařízení a konjugované zaostřovací zařízení a je to systém pro digitální získávání obrazu a zpracování prostřednictvím počítačové kontroly.
