Rozdíl mezi fluorescenčním mikroskopem a normálním mikroskopem
Nedávno jsem se pokusil udělat nějaké zmrazené části myší. Dále použiji fluorescenční mikroskop, abych zjistil, zda virus, který jsem vpíchl, je v oblasti mozku, kterou chci. Některé základní principy fluorescenční mikroskopie je třeba se stručně naučit a já se o ně zde podělím.
Fluorescenční mikroskopy používají ultrafialové světlo jako zdroj světla k osvětlení kontrolovaného objektu, což způsobí, že objekt vyzařuje světlo, a poté objekt pozoruje pod mikroskopem. Používá se především pro imunofluorescenční buňky. Skládá se především ze zdroje světla, systému filtračních desek a optického systému. Fluorescenční obraz vzorku je pozorován prostřednictvím zvětšení okuláru a čočky objektivu. Pojďme se podívat na rozdíl mezi fluorescenčním mikroskopem a obyčejným optickým mikroskopem.
1. Podívejte se na způsob osvětlení
Metoda osvětlení fluorescenčního mikroskopu je obecně epiiluminace, což znamená, že zdroj světla je umístěn na testovaný vzorek přes čočku objektivu.
2. Podívejte se na rozlišení
Fluorescenční mikroskopy využívají jako zdroj světla ultrafialové světlo, které má kratší vlnovou délku, ale vyšší rozlišení než běžné optické mikroskopy.
3. Rozdíly ve filtrech
Fluorescenční mikroskopy používají dva speciální filtry, jeden se používá před světelným zdrojem k odfiltrování viditelného světla a druhý se používá mezi čočkou objektivu a okulárem k odfiltrování ultrafialových paprsků, které mohou chránit lidské oči.
Fluorescenční mikroskop je také druh optického mikroskopu. Hlavním důvodem je, že vlnová délka excitovaná fluorescenčním mikroskopem je krátká, takže to vede k rozdílu ve struktuře a použití mezi fluorescenčním mikroskopem a běžným mikroskopem. Většina fluorescenčních mikroskopů má dobrou funkci pro zachycení slabého světla. , takže jeho zobrazovací schopnost je dobrá i při extrémně slabé fluorescenci. Ve spojení s neustálým zlepšováním fluorescenčních mikroskopů v posledních letech se také výrazně snížil šum. Proto se stále více používá fluorescenčních mikroskopů.
Znalosti o dvoufotonové fluorescenční mikroskopii
Základní princip dvoufotonové excitace je: za podmínky vysoké hustoty fotonů mohou fluorescenční molekuly absorbovat dva dlouhovlnné fotony současně a po krátké životnosti tzv. excitovaného stavu emitovat foton s kratší vlnovou délkou. . ;Účinek je stejný jako při použití fotonu s vlnovou délkou poloviční oproti dlouhé vlnové délce k excitaci fluorescenčních molekul. Dvoufotonová excitace vyžaduje vysokou hustotu fotonů. Aby nedošlo k poškození buněk, používají dvoufotonové mikroskopy vysokoenergetické pulzní lasery s uzamčeným režimem. Tento laser vyzařuje laserové světlo s vysokou špičkovou energií a nízkou průměrnou energií, s šířkou pulzu pouze 100 femtosekund a frekvencí 80 až 100 MHz. Při použití čočky objektivu s vysokou numerickou aperturou k zaostření fotonů pulzního laseru je hustota fotonů v ohnisku čočky objektivu nejvyšší. K dvoufotonové excitaci dochází pouze v ohnisku čočky objektivu, takže dvoufotonový mikroskop nevyžaduje konfokální dírku, což zlepšuje účinnost fluorescenční detekce.
V obecném fluorescenčním jevu může fluorescenční molekula v důsledku nízké hustoty fotonů excitačního světla absorbovat pouze jeden foton současně a poté emitovat jeden fluorescenční foton prostřednictvím radiačního přechodu. Jedná se o jednofotonovou fluorescenci. Pro fluorescenční excitační proces využívající laser jako zdroj světla může docházet k jevu dvoufotonové nebo dokonce vícefotonové fluorescence. V tomto případě je intenzita použitého zdroje excitačního světla vysoká a hustota fotonů splňuje požadavek, aby fluorescenční molekuly absorbovaly dva fotony současně. V procesu použití běžných laserů jako zdrojů excitačního světla hustota fotonů stále nestačí k produkci dvoufotonové absorpce. Obvykle se používají femtosekundové pulzní lasery, jejichž okamžitý výkon může dosáhnout úrovně megawattů. Proto je vlnová délka dvoufotonové fluorescence kratší než vlnová délka excitačního světla, což je ekvivalentní efektu vyvolanému excitací poloviční excitační vlnovou délkou.
