Trend vývoje konfokální mikroskopie
Pro získání lepších výsledků pozorování na technické úrovni se konfokální mikroskopie zaměřuje na zlepšení technické úrovně z aspektů zlepšení rozlišení, snížení fototoxicity, zvýšení rychlosti skenování, pozorování tlustých vzorků a pozorování in vivo. V současnosti je Z účinný. To, co podporuje Zda pro technologii konfokální mikroskopie, je mikroskopie s ultra vysokým rozlišením, která proráží optický limit a umožňuje výzkumníkům získat jemnější buněčné struktury, což vede k hlubšímu pochopení životních aktivit. Další výzkumné zaměření technologie konfokální mikroskopie by se mělo zaměřit na následující body:
1. Vyšší rychlost skenování
V současné době je rychlost konfokálního skenování omezena mechanickou strukturou skenovacího zařízení a rozlišení lze obětovat pouze za účelem dosažení vyšší rychlosti skenování. Mnoho biologických procesů je tak rychlých, že zůstávají nedetekovatelné.
2. Dokonalejší technologie s ultra vysokým rozlišením
V současnosti mezi technologie s ultravysokým rozlišením patří STORM, PALM, STED a SSIM s rozlišením od 20 do 200 nm, ale každá technologie má určité vady, jako je zpracování vzorků, směr osy Z, fototoxicita atd. není téměř dokonalé a při skutečném pozorování je často obtížné dosáhnout limitního rozlišení.
3. Silnější kompatibilita
Technologie konfokální mikroskopie zahrnuje celou řadu excitačních metod, jako je výše zmíněné multifotonové pozorování a pozorování světelných listů, a koherentní anti-Stokesův Ramanův rozptyl může teoreticky sdílet sadu laserových systémů. Mikroskopii s vysokým rozlišením lze spárovat s technologií bílého laseru. Vzhledem k patentovým problémům různých společností je však stále co vylepšovat, pokud jde o úplnost a kompatibilitu, a současná výbava nemůže dát naplno uplatnění technickým výhodám aplikace.
Principy konfokální mikroskopie
Konfokální mikroskop se skládá ze čtyř částí: optického systému mikroskopu, zdroje laserového světla, skeneru a systému detekce a zpracování. Jako zdroj světla využívá laser s dobrou koherencí. Přijímá princip konjugovaného zaostřování a zařízení na základě tradičního optického mikroskopu a používá počítačovou sadu pozorování, analýzy a výstupního systému pro zpracování obrazu.
Laserový skenovací paprsek prochází dírkou mřížky a vytváří bodový zdroj světla, který se odráží k čočce objektivu přes dělič paprsku, zaostřuje na vzorek a skenuje. Poté, co je vzorek excitován, emitovaná fluorescence se vrací do spektroskopu a shromažďuje ji v detekční dírce a poté je přeměněna na elektrický signál trubicí fotonásobiče a přenášena do počítače, aby se zobrazil jasný obraz ohniskové roviny. Budící světlo je zaostřeno na vzorek skrz dírku mřížky a fluorescence je zaostřena na dírku přes čočku objektivu. Tento proces tvoří dvě fokusace, proto se nazývá konfokální mikroskop.
Běžné biologické vzorky mají složitou strukturu a určitou tloušťku. Při pozorování běžným fluorescenčním mikroskopem se fluorescence emitovaná vzorkem vzájemně překrývá a rozlišení obrazu je značně sníženo.
Konfokální zobrazení konfokálního mikroskopu může účinně potlačit rozptýlené světlo a neměřené světlo mimo ohniskovou rovinu, aby vstoupilo do detektoru, realizovat zobrazení s jedinou ohniskovou rovinou a výrazně zlepšit rozlišení. Když se stolek pohybuje rovnoměrně v horizontálním směru, může vytvořit jasný jednovrstvý obraz a ve vertikálním směru může realizovat skenování vzorku po vrstvách v různých hloubkách a získat trojrozměrnou strukturu. vzorku po trojrozměrné rekonstrukci, což je tzv. „optické CT“. Vzorek se označí fluorescenční sondou a poté se pozoruje konfokálním mikroskopem. Nejen, že lze pozorovat různé fixované buňky a tkáňové struktury, ale také kvalitativně a kvantitativně sledovat a pravidelně měřit morfologii, strukturu a ionty živých buněk.
