Stanovení počtu mikroorganismů - metoda přímého počítání mikroskopu!
Růst bakteriální populace se projevuje zvýšením počtu buněk nebo nárůstem buněčné hmoty. Metody pro stanovení počtu buněk zahrnují metodu přímého mikroskopického počítání, metodu počítání kolonií na destičkách, metodu poměru fotoelektrického oleje, metodu maximální pravděpodobnosti a metodu membránové filtrace. Metody měření buněčné hmoty zahrnují stanovení sušiny buněk, stanovení určitých buněčných složek, jako je obsah dusíku, RNA a DNA, a stanovení metabolitů. Stručně řečeno, existuje mnoho metod měření růstu mikroorganismů, z nichž každá má své výhody a nevýhody, a měly by být vybírány podle konkrétní situace. Tento experiment představuje především metodu přímého počítání mikroskopem běžně používanou ve výrobě a vědeckém výzkumu.
1. Požadavky na účel
1. Objasněte princip krevního obrazu.
2. Osvojit si metodu počítání mikroorganismů pomocí počítadla krvinek.
2. Základní principy
Mikroskopická metoda přímého počítání je jednoduchá, rychlá a intuitivní metoda pro přímé počítání malého množství suspenze vzorku, který má být testován na speciálním podložním sklíčku s určitou plochou a objemem (také známé jako počítadlo bakterií). Metody. V současnosti jsou běžně používané počítadla bakterií doma i v zahraničí: deska na počítání krvinek, počítadlo bakterií Peteroff-Hauser a počítadlo bakterií Hawksley atd. Lze je použít pro počítání kvasinek, bakterií, spor plísní a dalších suspenzí, popř. základní princip je stejný. Poslední dva typy čítačů bakterií mají celkový objem 0.02 mm3 po zakrytí krycím sklem a vzdálenost mezi krycím sklem a sklíčkem je pouze 0,02 mm, takže olej imerzní čočku objektivu lze použít k pozorování a pozorování malých buněk, jako jsou bakterie. počet. Kromě těchto bakteriometrů existuje i metoda odhadu poměru plochy nátěru k ploše zorného pole pozorované přímo pod mikroskopem, která se obecně používá pro bakteriologické vyšetření mléka. Výhody metody přímého počítání mikroskopem jsou intuitivní, rychlé a snadno ovladatelné. Nevýhodou této metody však je, že naměřeným výsledkem je většinou součet mrtvých a živých buněk. V současnosti existují některé metody, jak tento nedostatek překonat, jako je kombinace barvení mikrokomorové kultury životaschopnými bakteriemi (krátká doba) a přidání inhibitorů buněčného dělení k dosažení účelu počítání pouze životaschopných bakterií.
V tomto experimentu byl použit hemocytometr jako příklad pro přímé mikroskopické počítání. Pro použití dalších dvou typů počítadel bakterií se prosím řiďte pokyny jednotlivých výrobců. Počítání přímo pod mikroskopem pomocí hemocytometru je běžně používaná metoda pro počítání mikroorganismů. Počítací deska je speciální skleněné sklíčko, na kterém jsou čtyři štěrbiny tvořeny třemi plošinami; širší plošina uprostřed je rozdělena na dvě poloviny krátkou příčnou štěrbinou a na každé straně plošiny je mřížka. Každá mřížka je rozdělena na devět velkých čtverců a velký čtverec uprostřed je počítací místnost. Struktura destičky na počítání krvinek je znázorněna na obrázku l{{{{10}}}}. Měřítko počítací místnosti má obecně dvě specifikace, jeden je velký čtverec rozdělený na 25 středních čtverců a každý střední čtverec je rozdělen na 16 malých čtverců (obrázek 15-2); druhý je velký čtverec. Čtverec je rozdělen na 16 středních polí a každé prostřední pole je rozděleno na 25 malých polí, ale bez ohledu na to, o jaký druh počítací desky se jedná, v každém velkém políčku je 400 malých polí. Délka strany každého velkého čtverce je 1 mm a plocha každého velkého čtverce je 1 mm2. Po zakrytí krycím sklem je výška mezi krycím sklem a podložním sklíčkem 0,1 mm, objem počítací komůrky je tedy 0,lmm3 (tisícina mililitru). Obrázek 15-1 Struktura desky pro počítání krvinek (1) Obrázek 15-2 Struktura desky pro počítání krvinek (2) A. Pohled zepředu; B. Pohled v podélném řezu; Zvětšená mřížka, velký čtverec uprostřed je počítací komora 1. Krvinky Počítací destička; 2. Krycí sklo; 3. Při počítání v počítací komoře obvykle spočítejte celkový počet bakterií v pěti čtvercích, pak vypočítejte průměr každého čtverce a vynásobte 25 nebo 16, abyste dostali Celkový počet bakterií ve velkém čtverci se pak převede na celkový počet bakterií v 1ml bakteriálního roztoku. Nechť celkový počet bakterií v pěti čtvercích je A a poměr ředění bakteriálního roztoku je B. Pokud se jedná o počítací destičku s 25 čtverci, celkový počet bakterií v 1 ml bakteriálního roztoku {{26} } A/5×25×104× B=50000A·B(kusy) Podobně, pokud se jedná o počítací misku se 16 středními čtverečky, celkový počet bakterií v 1 ml bakteriálního roztoku=A/ 5×16×104×B=32000A·B (kusy)
3. Vybavení
1. Bakterie
Saccharomyces cerevisiae
2. Nástroje nebo jiné náčiní
Hemocytometr, mikroskop, krycí sklíčko, sterilní kapilární kapátko.
4. Operační kroky
1. Příprava bakteriální suspenze
Saccharomyces cerevisiae byl připraven do bakteriální suspenze vhodné koncentrace se sterilním fyziologickým roztokem.
2. Místnost pro počítání mikroskopů
Před přidáním vzorků mikroskopicky zkontrolujte počítací komůrku počítací destičky. Pokud jsou nečistoty, je třeba je před počítáním vyčistit a vysušit.
3. Přidejte vzorek
Čistý a suchý hemocytometr zakryjte krycím sklíčkem a poté pomocí sterilního kapilárního kapátka kápněte malou kapku protřepané suspenze Saccharomyces cerevisiae z okraje krycího sklíčka a nechte bakteriální roztok automaticky pohybovat po mezeře kapilární osmózou. Při vstupu do počítací místnosti lze obecnou počítací místnost naplnit bakteriální kapalinou. Při odběru vzorků nejprve protřepejte bakteriální roztok; při přidávání vzorků by v počítací komoře neměly vznikat žádné vzduchové bubliny.
4. Počítání v mikroskopu
Po přidání vzorku zůstaňte 5 minut v klidu, poté umístěte hemocytometr na stolek mikroskopu, nejprve najděte umístění počítací komůrky pomocí nízkovýkonového mikroskopu a poté přepněte na vysoce výkonný mikroskop pro počítání. Přiměřeně upravte intenzitu světla mikroskopu. U mikroskopů, které používají k osvětlení zrcadla, dávejte pozor, abyste se neodchýlili od jedné strany světla, jinak nebude v zorném poli dobře vidět čtvercové čáry počítací místnosti, nebo budou pouze svislé čáry nebo vodorovné čáry být viděn. Pokud se před počítáním zjistí, že bakteriální roztok je příliš koncentrovaný nebo příliš zředěný, je nutné před počítáním znovu upravit ředění. Obecně ředění vzorku vyžaduje asi 5 až 10 bakterií v každé malé buňce. Každá počítací komora vybere 5 středních buněk (volitelně 4 rohy a jednu střední buňku uprostřed) pro počítání. Buňky umístěné na čáře mřížky se obecně počítají pouze na horní a pravé čáře. V případě pučení kvasinek, kdy velikost pupenu dosahuje poloviny mateřské buňky, se počítá jako dvě bakteriální buňky. Chcete-li vzorek spočítat, vypočítejte bakteriální obsah vzorku výpočtem průměrné hodnoty ze dvou počítacích komůrek.
5. Umyjte krevní obraz
Po použití desku na počítání krvinek opláchněte vodou z vodovodu, nedrhněte tvrdými předměty a po umytí ji osušte sami nebo fénem. Mikroskopické vyšetření ke zjištění, zda jsou v každé malé buňce zbytkové bakterie nebo jiné sedimenty. Pokud není čistý, musí se opakovaně umýt, dokud nebude čistý.
